RT-PCR引物设计与是否跨内含子的检测方法(图).doc

问题一：如何在pubmed上找到目标基因的DNA序列以及其内含子和外显子情况。 步骤：打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因（fig.1）-》找到你要的种属，打开-》显示基因信息，找到”Genomic regions, transcripts, and products”，点击基因名称，links到geneback（fig.2）-》显示了该基因DNA的信息(fig.3)，可以看到这是基因组DNA,从mRNA选项中可以看到JION后面的是外显子的位置，该基因一个共有3个内含子，4个外显子，以及外显子的起至位置，为了以后的操作，可以把这个DNA序列和外显子的起至位置记下来。 问题二：如何在pubmed上找到目标基因的mRNA序列。 步骤：打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属，打开-》显示基因信息，找到“mRNA and protein”前面那个NM***********,号码（fig.4），把它记下来（后面的blast要用）并点开-》显示这个基因的mRNA信息(Fig.5)，最后的ORIGIN是CDNA序列，把它记下来，一会PRIMER的时候要用。 问题三：如何设计跨内含子的引物（利用primer-blast） 1）打开primer-blast网站：（/tools/primer-blast/） 2）将mRNA编号（NM***********）输入序列框中，real time PCR 一般产物长度为80～150bp也可以超一点，但是会影响扩增效率，这样就不能用ddCT法计算了，酌情考虑。温度在55～63和GC含量在40%～60%，两条链不要差太远。 3)会得到若干条引物（fig。6），红条中的黄圈标记的小白色缺口是内含子所在的位置，跨过小缺口就是跨了内含子。根据下面列出的引物具体的温度GC含量之类的再进行选择。 4）将初步选择的引物用PRIMER 5验证引物二聚体，发卡结构等，方法见下个问题“问题四：用PRIMER 5查找已知引物的产物位置”。 问题四：如何利用MRNA序列和DNA序列，用PRIMER 5查找已知引物的产物位置，并确定其是否跨内含子。 1）找到目的引物的DNA序列和MRNA（cdna）序列，以问题三中用primer-blast设计的第8条引物为例。 2）打开PRIMER 5，将CDNA序列贴入-》点击primer-》显示primer primer界面-》点击左上方的“S”，再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面，在“5‘-3‘”框中贴入已知的Forward primer，点击as is，显示序列已被贴入-》点击analyze，再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对，点击OK-显示“primer primer界面” 点击左上方的“A”，再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面，在“3‘-5‘”框中贴入已知的REVERSE primer，点击REVERSE，显示序列已被贴入-》点击analyze，再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对，点击OK-显示“primer primer界面”-在右上角显示PCR产物的起始和结束位点，得到产物长度为145bp。 3）打开PRIMER 5，将DNA序列贴入-》点击primer-》显示primer primer界面-》点击左上方的“S”，再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面，在“5‘-3‘”框中贴入已知的Forward primer，点击as is，显示序列已被贴入-》点击analyze，再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对，点击OK-显示“primer primer界面” 点击左上方的“A”，再点击EDIT primer -》显示EDIT primer界面，在“3‘-5‘”框中贴入已知的REVERSE primer，点击REVERSE，显示序列已被贴入-》点击analyze，再点击primer-》显示输入的序列和已知CDNA良好配对，点击OK-显示“primer primer界面”-在右上角显示PCR产物的起始和结束位点。 4）该引物利用DNA做模板产生的产物从95-1374，长度为1280bp，由上可知120-1254（长度1134）是内含子，那么，扣除内含子的产物应该是145bp。 5）所以，这是一条跨内含子的引物。