09实验九动物组织和细胞中核酸的提取和测定.doc

实验 动物组织和细胞中核酸的提取和测定 第一部分 动物组织和细胞中DNA和RNA的提取 实验目的 学习从组织和细胞中提取DNA和RNA的方法 实验原理从动物组织和细胞中提取DNA DNA存在于细胞核中。提取DNA的方法首先需要温和裂解细胞及溶解DNA的技术，接着需采用化学和酶学方法，除去杂蛋白、RNA及其他的大分子。本实验在EDTA（螯合二价阳离子以抑制Dnase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞和组织，用去垢剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂抽提得以纯化，污染的RNA通过RNase消化清除。这个方法可产生十微克至数百微克的DNA，适用于标准琼脂糖凝胶上的Southern分析，可用作PCR反应的模板，以及用于构建基因组DNA文库。2.从动物组织和细胞中提取RNA RNA存在于细胞质及核中，是一种极易降解的核酸分子。为了快速从细胞中分离完整的RNA，许多方法都用到了高浓度的强变性剂硫氰酸胍使细胞破裂。高浓度的硫氰酸胍还使细胞内的各种RNA酶失活，使释放出的RNA不被降解。细胞裂解后存在于裂解溶液内的有RNA，核DNA，蛋白质和细胞残片，通过酚，氯仿等有机溶剂处理，离心，使RNA最终与其它细胞组分分离开来。实验器材 研钵和研棒匀浆机橡胶刮棒低温冷冻离心机恒温水浴宽口移液管锤子塑料袋涡旋裂解缓冲液10mmol/L Tris-Cl (PH8.0)，0.1mol/L EDTA (PH8.0)，0.5%(m/V) SDS，20μg/mg无Dnase的胰RNase裂解缓冲液的前三种成分可预先混合并于室温保存。RNase在用前适量加入。溶液D(变性液)：4 mol/L 硫氰酸胍25mmol/L 柠檬酸钠. 2H200.5%(m/V)月桂基肌酸钠0.1mol/L β-巯基乙醇将250g硫氰酸胍、0.75mol/L(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和26.4ml10%(m/V )月桂基肌酸钠溶于293 ml水中.加入搅拌子于磁力搅拌器上65℃混匀,直至完全溶解。室温贮存溶液D,每次使用前加入14.4 mol/L的β-巯基乙醇,每50ml溶液D加0.36ml。溶液D可在室温下避光保存数月。平衡酚：用0.5mol/L Tris-Cl (PH8.0)平衡的苯酚TBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱、加入0.015g酚红并用HCl调节溶液的PH值至7.4,加水定容至1L,分装后在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。PBS：在800 ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4, 用HCl调节溶液的PH值至7.4, 加水定容至1L, 在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。保存于室温。TE（PH8.0）（PH8.0）（PH8.0）蛋白酶K（20mg/ml）10mol／L醋酸铵2mol／L的醋酸钠 (pH4.0)0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）无水乙醇70％乙醇氯仿—异戊醇(49:1,V/V)异丙醇酚 液氮 实验操作 (一) 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物组织和细胞中分离DNA 组织样品和培养细胞的裂解 组织样品 ① 将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。 ② 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。 ③ 将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤。 培养细胞 ①单层培养细胞 从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，加入1ml新鲜的冰冷的TBS。 用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用0.5 ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。 于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。 将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。 用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤。 ②悬浮培养的细胞 将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。 用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的TBS中，离心收集细胞。 去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤。 将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。 加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100μg/ml。用一灭菌玻