褐藻胶裂解酶基因alyB的重组表达及性质研究.ppt

褐藻胶裂解酶基因alyB的重组表达及性质研究 答辩人：杜海波 指导老师：韩峰 汇 报 内 容 前言 实验材料和方法 结果及讨论 褐藻胶的结构 褐藻胶，又称褐藻酸多糖，是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种糖单元交替组合形成的线性高分子量聚合物。 褐藻胶的来源 褐藻胶广泛存在于巨藻、海带、昆布、鹿角菜、墨角藻和马尾藻等上百种褐藻的细胞壁以及细胞间质中。在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）等致病菌和土壤微生物中也分离得到了褐藻胶。 褐藻胶低聚糖的生物活性及其应用 褐藻胶低聚糖包括海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、海藻酸铵等。褐藻胶低聚糖属纯天然多糖，具有特殊的生理活性，对改善人体生理功能，提高免疫力具有重要的作用。可广泛用于食品、保健品和药品。 褐 藻 胶 裂 解 酶 褐藻胶裂解酶，又称褐藻胶裂合酶，英文名称作alginate lyase。 褐藻胶裂解酶主要有两个来源： 动物：包括海洋软体动物和棘皮动物等。 微生物：包括海洋细菌、土壤细菌和真菌等。 按其降解褐藻胶嵌段(底物专一性)的不同可分为三类： 专一性裂解1，4—β—D—甘露糖醛酸片段的裂解酶(Aly；Ec 4.2.2.3) 专一性裂解1，4—α—L—古罗糖醛酸片段的裂解酶(Aly；EC 4.2.2.111) 两种片段都可裂解的双功能裂解酶 褐 藻 胶 裂 解 酶 的 作 用 机 制 褐藻胶裂解酶通过β消去反应裂解褐藻胶的糖苷键，催化底 物分子分裂成两部分，其作用位点是β（1→4）糖苷键。 在裂解的4-O糖苷键所在的糖环的 C4 和C5 位置间形成双键。在褐 藻胶解聚的同时，在产物的非还 原性末端形成4─deoxy─L— erythro─hex─4─enopyranosy —luronate残基的寡聚糖醛酸。 褐 藻 胶 裂 解 酶 的 生 物 学 功 能 及 应 用 以海草碎片为食物的海洋动物，通常在它们的消化腔产生多种降解糖的酶,包括琼胶酶，纤维素酶以及褐藻胶裂解酶。这种糖酶的混合物使这些海洋动物能够有效的利用从藻类中获得的能量。 在囊性纤维化病人的肺部获得的P.aeruginosa菌株，产生像粘液一样的褐藻胶多糖，形成生物膜结构。这种生物膜结构对其中的细菌进行保护。粘性细菌P.aeruginosa在一定条件下，褐藻胶裂解酶基因会过量表达，降解了周围的褐藻胶，使细菌更容易从固着表面分离，扩散到周围环境。因此P.aeruginosa生物膜中褐藻胶的降解，加强了细菌的扩散能力，使细菌可以在新的位点快速附着与传播。 褐藻胶裂解酶用作海藻解壁酶,以获得DNA、单细胞和原生质体。 在医学上，褐藻胶裂解酶早已作为药品酶用于治疗由致病菌Pseudomons．aeruginosa引起的肺炎。 实验材料和方法 AlyB的表达与制备 使用LB液体培养基（pH7.0）于37℃振荡培养含有alyB基因的E.coli菌株，至OD600 ≈ 0.5; 加入IPTG至终浓度1 mM诱导,在25℃继续培养14h； 发酵液以10,000g，4℃，离心10min，弃去上清；使用20 mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)重悬浮菌体至OD600 ≈5.0，冰浴放置10 min； 超声破碎菌体(时间：30 min；脉冲：9.9 s，9.9 s；功率：60%)后，细胞裂解液以10,000g，4 ℃，离心10 min，留取上清。 粗酶纯化 硫酸铵沉淀 向上述制备的上清液中缓慢加入硫酸铵至80％饱和度，4 ℃静置3 h；10，000xg,离心30 min，弃去上清；沉淀溶于20 mM pH7.5磷酸盐缓冲液，4℃透析过夜进行脱盐，即为粗酶液。 DEAE Sepharose Fast Flow柱离子交换层析 粗酶液上样于以20mM pH 7.5磷酸盐缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱进行离子交换层析。采取NaCl浓度梯度洗脱(A液为20mM pH 7.5磷酸盐缓冲液，B液为含有2.0M NaC1的A液)，检测收集物活性，大量收集活性组分，浓缩备用。 Superdex 75 HR 10/30柱凝胶过滤层析 活性组分上样于以20 mM pH7.5磷酸盐缓冲液平衡的Superdex 75 HR 10/30柱用，以水洗脱，检测收集物活性，大量收集高活性组分，浓缩备用。 酶活的紫外吸收法测定 根据文献报道：褐藻胶裂解酶催化褐藻胶糖苷键的水解，并在非还原性末端产生C4,5不饱和双键，该双键与C6 -羧羰基形成共轭结构，且在230-240 nm存在强吸收。根据褐藻胶裂解酶的这一特点，参