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CMVpp65抗原血症检测改良法在 活动性CMV感染诊断中的应用 天津市儿童医院 病理科 胡晓丽 我国是人巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)感染的高发地区,大多数原发性感染发 生于婴幼儿期。研究发现，CMV的组织嗜 性与宿主年龄和免疫状况密切相关,巨细胞 病毒（CMV）感染是由巨细胞病毒侵入机 体,在细胞内增殖,同时造成组织器官病变。 虽然大多数感染者无明显症状，成为潜伏 性感染，然而由于婴幼儿免疫系统尚未发 育完善，可导致严重的CMV病，婴幼儿因 此成为最大的易感人群。CMV感染因此成 为儿童常见的病毒感染性疾病之一，因而 如何早期、快速而精确地诊断CMV活动性 感染已成为监测CMV感染状况、及时给予 抗病毒治疗以及判断预后的关键。 CMVpp65抗原血症的检测在反映CMV活动 性感染方面均显著优于其他检测方法。我 们于2010年9月开展此项目至今。现报道如 下 一、材料和方法 1.标本来源病例来自天津市儿童医院2010 年9月～2016年9月送检的抗凝静脉血标本 5255例，男：3443例，女：1812例，男： 女为1.9：1。年龄最小1天，最大16岁，中 位年龄2个月。 2．主要仪器设备及试剂利群离心式液基 细胞制片机MCT2000，恒温水育箱， Olympus BX51荧光显微镜，红细胞裂解 液、固定液、胎牛血清、细胞穿透液、鼠 抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体（anti HCMV pp65）和FITC兔抗鼠二抗均购自 Diasorin公司 3．染色方法制片染色步骤包括直接裂解 法提取白细胞、细胞计数、液基细胞制片、 穿透液破膜、固定、间接免疫荧光法染色。 应用试剂盒提供的已知阳性片作阳性对照， 用PBS代替一抗作阴性对照。 制片染色具体步骤如下： （1）提取白细胞：新鲜抗凝静脉血1ml- 2ml，加入红细胞裂解液18ml，4℃静置5 分钟；3000转离心5分钟，弃上清；如有较 多红细胞，重复1次；1mlPBS 重悬嗜中性 白细胞，3000转离心5分钟，弃上清，以洗 涤嗜中性白细胞；1mlPBS 重悬嗜中性白 细胞； （2 ）计算白细胞浓度：取10ul稀释50倍， 细胞计数板或自动细胞计数仪计数，计算 嗜中性白细胞浓度。 5 （3）液基细胞学制片：取2 ×10 嗜中性白细 胞，放入液基细胞制片夹中，800转3分钟 离心制片，室温通风橱风干。 （4 ）间接免疫荧光法染色：滴加固定液固 定10 min，PBS洗1min×2次；滴加穿透 液破膜5 min，PBS洗1min×2次；滴加1 ％胎牛血清封闭，室温下孵育5min；弃去 多余血清，滴加适量CMVpp65一抗，置于 湿盒中，37℃水浴孵育30分钟，PBS柔洗 1min×2次； 滴加荧光标记二抗工作液，37℃水浴箱中 孵育30分钟，PBS柔洗1min×2次，蒸馏 水洗1min室温风干后，封片，荧光显微镜 下计数CMV pp65阳性细胞数。 4 ．结果判定荧光显微镜下观察，整个嗜中 性粒细胞核呈绿色荧光判为阳性细胞。结 5 果以2 ×10 个白细胞中CMV pp65抗原阳性 细胞≥1个判为阳性，并标明阳性细胞个数。 二、结果 5255例送检抗凝血标本中，CMVpp65抗 原血症阳性1121例，阳性率21.33%，阳性 病例中男747例，女374例。年龄最小20天， 最大为7岁，中位年龄2月。阳性细胞计数 范围为每20万白细胞中1个至500个阳性 细胞，阳性细胞计数均数为每20万白细胞 中9个阳性细胞。 嗜中性粒细胞的细胞核呈绿色荧光。其阳 性数量多少与临床症状呈明显的正相关性。 阳性患儿经抗CMV感染（更昔洛韦）治疗 明显好转至消失，复查血CMVpp65抗原转 阴后停药。 1.结果判读 荧光显微镜的选择市售二抗中通常含有0.02 ％伊 文思蓝，细胞被伊文思蓝衬染后，在蓝色激发光 下可显示红色的背景荧光，用配置长通的蓝色激 发模块滤光片（＞515nm）荧光显微镜观察，既 可见绿色荧光的阳性细胞，也可见阴性的细胞的 红色背景（如图1C），方便阅片者随时对焦，提 高阅片速度； 如用窄带通发射滤光片观察，仅显示阳性 细胞的绿色荧光部分（图1D），如视野中 无阳性细胞，则为黑色，将无法对焦，推 片器移动时亦不能动态对焦，更不能