第三章 酶分离纯化 to 学生.pptVIP

Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme;3.1 酶的提取、分离纯化技术路线;酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。;3.2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎;酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂： 极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中， 酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 ; 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。;酶的主要提取方法;3.4 酶的分离方法;1、沉淀分离;盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低 ;例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。 溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集， 同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 ;2、离心分离;离心机种类;3、过滤与膜分离;过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 ) ;膜技术 ;4、层析分离;层析分离方法;吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。 吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。 吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。;分配层析;凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。 多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离;亲和层析;5、电泳分离;6、萃取分离;各种双水相系统;3.5 酶的组合分离纯化策略;豌彰论姐掏瘩勤梭肌裤圆盔炼窄探川衔汝额鸿睬自怪婆畅巧诣稍肌远顺啄第三章 酶分离纯化 to 学生第三章 酶分离纯化 to 学生;3.6 酶的浓缩、干燥与结晶;干燥 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。 常用的干燥方法有： 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥;结晶 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。 酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。 要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在纯度达到50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。 盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶 ;第三章 重点内容