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药学院中心实验室系列技术讲座之十三 邵伟艳 2014-11-07  表观遗传学  组蛋白及其生物学意义  研究蛋白质结构的主要手段  核磁共振技术研究蛋白质结构及动力学  遗传学(genetics): 指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基 因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；  表观遗传学 (epigenomics): 指基于非基因序列改变所致基因表达水平 变化，且这种变化是基因功能的可逆的、可遗传的改变。 表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化、基因组印记、母体效 应、基因沉默、核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑等.  组蛋白及其研究意义 ：  组蛋白及其研究意义 ： 1.染色质作为真核生物遗传信息的载体，其基本结构与功能单位是 核小体。 2. 真核生物核小体是由核心组蛋白八聚体，包括H2A-H2B二聚体、 (H3-H4)2四聚体和缠绕在其上的DNA，以及连接组蛋白H1共同构 成。 组蛋白变化： 组蛋白修饰：其化学类型已超过25种，包 括甲基化，酰基化，磷酸化等。这些组蛋 白修饰及其组合被认为构成一组广义上的 “组蛋白密码”，是表观遗传调控的重要机 制之一。 组蛋白变体：是相对于染色体中常规的组 蛋白序列（H2A、H2B、H3、H4和H1）， 其蛋白序列发生变化的其他组蛋白，是特 殊状态的染色体所需的组蛋白的类型。 组蛋白变体和组蛋白修饰赋予组蛋白巨大的信息荷载能力，参与构成 一层超越DNA序列的表观遗传信息，在染色质结构调节及基因表达调控 等过程中起着关键作用。且目前发现很多疾病与组蛋白修饰异常及组蛋白 变体替换有着非常重要的关联，因此研究组蛋白修饰的产生，消除以及读 取机制，组蛋白变体在特殊基因转录过程中的作用，对深入了解基因功能 调控机制以及疾病的发生和治疗等都有着重要意义。 研究关键问题： 蛋白结构，蛋白-蛋白相互作用及发挥功能的动力学信息 研究蛋白质结构的主要技术 ： 特点： 仅次于X-单晶衍射技术（约15% in PDB）  优点： 不需结晶，可研究动力学 缺点： 受分子量限制，需要标记 涉及的元素： 标记：受分子量限制，对于分子量大于10 kD而小于25 kD的蛋白质，由 于氢谱的谱峰重叠比较严重，通常采用均一化13C和15N标记的样品，以 提高检测灵敏度和分辨率，便于进行化学位移归属和结构解析． 对大于25kD蛋白样品，需要特殊策略的标记蛋白，如选择性甲基质子 化、2H标记、反向标记和片段同位素标记技术。  大肠杆菌表达系统：在基本培养基中使用15N标记的氮源(如15 NH4C1， 15(NH4)2SO4)，13C标记的碳源(如13 C一葡萄糖，13C一甘油)作为唯一 氮源和碳源，经济可靠。缺点 ：存在翻译后无法修饰或构象折叠困难。  无细胞蛋白表达系统：在含有全部20种氨基酸的来自细菌或小麦细菌提取 物的无细胞培养基中进行蛋白质表达，表达方式可控并且分子量较大， 40kD.  仪器磁场要求： 高磁场强度： 分辨率和灵敏度提高 高稳定性、 高均匀度 1.化学位移的 归属：归属蛋 白质分子中能 产生核磁共振 信号的各个原 子的化学位移 值，分为主链 和侧链化学位 移归属两个部 分． 例：A β40 与小分子多 酚化合物混 合后，其1H 化学位移主 链和侧链全 归属。 NOE相关： 两个空间距离接近的原子通过空间进行磁矩传递，其效应的强度与距 离的六次方成反比。通常0.5nm的距离可被检测到NOE效应。3D NOESY-HSQC， 13C NOESY-HSQC实验。 二面角测定：蛋白不同结构区域内主链肽键的二面角不同，可通过测定J3 键耦合常 数确定。 氢键：主要通过蛋白质在重水中发生的主链酰胺氢-氘置换反应获得。 偶极耦合：提供蛋白质分子内各个化学键的取向信息，且能提供不同二级结构域或 二级结构区的相对空间取向，对蛋白质三维结构的精确解析提供必要信息。 A β 40