试验十一植物细胞骨架的观察.PPT

实验四 植物细胞骨架的观察 一、实验目的 1. 掌握考马斯亮蓝R250 对植物细胞骨架染色的方法。 2. 通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。 二、实验原理 细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。 三、实验用品 （一）材料 ： 洋葱 （二）器材： 显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、 PH 计 （三）试剂： 1、 0.01mol/L 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) 0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3） 50ml、0.15mol/L NaCl、加双蒸馏水加至1000ml 2、 PB 0.2mol/L Na2HPO4 77ml 0.2mol/L NaH2PO4 23ml 3、 M-缓冲液 咪唑(PH 6.7) 50mmol/L KCl 50mmol/L MgC12 0.5mmol/L EGTA 1mmol/L EDTA 0.1mmol/L 巯基乙醇 1mmol/L 甘油 4mmol/L 用1mol/L HCl 调pH 至7.2。 4、1%的Triton X-100/M-缓冲液 5、 0.2%考马斯亮蓝R250 染液 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸馏水 46.5ml 6、 3%戊二醛- PB 溶液（PH7.3） 四、实验操作：见下图： 取洋葱内皮1cm 左右  置于含PBS 液的载玻片上  湿润后，吸去PBS  加2 滴1%Triton X-100/M-缓冲液，5min  吸去缓冲液，加3%戊二醛-PB 溶液，固定30min  加PBS 洗2 次，共3min  加0.2%考马斯亮蓝R250 染色30min  用PBS 洗2 次，共2min，吸干  镜检并绘图 五、实验建议 1、 用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理材料时，应控制在30min 左右。 2、 每一次加液或染色后，应用PBS 洗2 次，并用滤纸吸干。 六、实验报告及作业 1、 画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。 2、为什么用TritonX-100 的缓冲液处理材料？ * *