第四章 愈伤组织培养.ppt

1、外植体的选择 一般情况下： 双子叶植物 比 单子叶和裸子植物容易 幼年细胞和组织比成年的容易 二倍体细胞比单倍体细胞容易 同一种植物不同基因型诱导愈伤组织的能力也不相同（24个水稻抗稻瘟病单基因鉴别品系悬浮细胞系的建立，14.3%~97.1%,周晓罡等，西南农业学报，2008年03期 ） 2、培养条件 生长素：2,4-D、NAA、IAA等 细胞分裂素 ：6-BA 、KT、ZT等 （一）诱导期（起动期） 1、特点 ①细胞的气体交换迅速增加。 ② 多聚核糖体不断增加：截止M期前，每个细胞中的 RNA含量增加到300％； ③蛋白质发生周期性的积累：每个分裂细胞的总增加量约为200％； ④?酶活力也发生一定的变化：DNA聚合酶活力增加、与代谢有关的酶类，如己糖激酶和一些脱氢酶的活力也增加。 ⑤细胞的大小基本没有变化。 （二）分裂期（Cell division） 1、分裂期细胞的特征 ①外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。细胞的数目迅速增加。胡萝卜组织培养7d后，细胞数可增加10倍。 ②?每个细胞平均鲜重下降。 ③?细胞体积小，内无液泡。 ④核和核仁增大到最大。 ⑤RNA含量减少，而DNA含量保持不变。 ⑥随着细胞不断分裂和组织生长，组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。 细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。 （三）分化期（ Differentiation） 2、愈伤组织的特点 生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽；也有浅绿色或绿色；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。 Callus may have a yellow, white, green or red (anthocyanin 花青苷) appearance. 一、形态学 1、色泽：一般为淡黄色、绿色或白色，亦可为红色。 影响因素：葡萄糖的水平，可溶性淀粉的存在，缺氮、温度、光及外源激素等营养物质和环境因素 。 2、质地 疏松 致密 二、细胞学 第三节 愈伤组织培养中的形态发生及体细胞胚胎发生 （一）细胞的分化 1、在培养中，已观察到的细胞类型 薄壁细胞 分生细胞 管胞 色素细胞 石细胞 纤维细胞等， 其中以维管组织（特别是木质部）的分化最为常见。 2、影响维管组织分化的主要因素 激素 生长素：起到主要的作用，低浓度刺激木质部分化。 激动素： 可以增加愈伤组织中管胞形成的比例；激动素和生长素协同增效作用 BAP，2-iP和ZT也有一定的作用，但没有证据证明他们的普遍性。 蔗糖 在丁香的组织培养中，当生长素浓度不改变而变化蔗糖浓度时，在蔗糖浓度为1.5～2.5％的范围时，愈伤组织内仅形成木质部；超过4％时则几乎完全为韧皮部；在2.5～3.5％时，既形成木质部也形成韧皮部。 物理因素：研究较少。光、温度对木质部的形成有一定的影响。 （二）器官分化 1、通过器官发生途径产生再生植株的基本方式有3种（konar等，1972） 芽 根 植株 ：普遍 愈伤组织 根 芽 植株：根有抑制芽 产生的影响 根和芽 植株 2、影响因素 激素 2.4-D与KT：比例较高时，有利于茎的形成，反之，有利于根的形成。 赤霉素（GA3）：抑制烟草、紫雪花（Plumbago indica）秋海棠（Begonia）及水稻的器官分化。 GA3的完全抑制作用只发生在黑暗条件下。 乙烯：对芽的分化有一定作用，作用方向与植物种类和处理的时间有关。 物理因素 光强、光质和光周期：一般光强为1000～15001x，光周期12～16h，近紫外和蓝紫光促进芽的发生，而红光显著促进长根。 温度 ：25℃左右的培养温度适于器官发生，但接近于植物原产地的生长温度对培养物更有利。 2、愈伤组织中胚状体特征 ① 二极性 在组织培养的器官发生过程中，愈伤组织是一团无极性分化的细胞团，器官分化中芽或根分化只是具单极性，而胚状体在分化初期就具胚根和胚芽两极，具明显的形态特征上的极性（Polarity）类似于合子发育中的种子结构。 ② 生理隔离（physiological isolation）： 指体细胞胚与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间形成缝隙，处于较独立的状态，尽管细胞组织间仍有胞间连丝存在，这是体细胞胚获得营养，激素及能量来源的通道，其后这些细胞趋于解体。 ③ 遗传稳定 胚状体起源于单细胞或细胞团，在其产生和发育过程中，一旦形成即通过了分化过程，结构即稳定无需