用激光共聚焦显微术在小鼠卵母细胞中检测蛋白激酶.pdfVIP

9·00 · 生物化学与生物物理进展 　　Prog. Biochem. Biophys. 　　　　　2001 ; 28 (6) 技术与方法 用激光共聚焦显微术在小鼠卵母细胞中 检测蛋白激酶 C 范衡宇1) 　佟 　超1) 　李满玉2) 　孙青原1) ( 1) 中国科学院动物研究所 , 计划生育生殖生物学国家重点实验室 , 北京 100080 ; 2) 中国农业大学动物医学院 , 北京 100094) 摘要 　用免疫荧光化学与激光共聚焦显微术结合的方法研究了小鼠卵母细胞中蛋白激酶 C ( PKC) α和 βⅠ的表 达和定位 , 以及蛋白激酶 C ( PKC) 和皮质颗粒的双标记 , 探讨了以哺乳动物卵母细胞为实验对象进行免疫荧光 共聚焦显微研究的简便方法. 结果发现 , PKC α和 βⅠ在小鼠生发泡期和 M Ⅱ期卵母细胞中都有表达 , 但表达部 位存在差异. 说明采用改进的激光共聚焦显微术 , 可以方便 、灵敏地检测特异蛋白质在卵母细胞中的表达部位 , 从而为生殖 、发育研究提供有效手段. 关键词 　激光共聚焦显微术 , 卵母细胞 , 蛋白激酶 C 学科分类号 　Q26 　　激光共聚焦显微术 (confocal laser microscop y) 08～2 μ m 的圆形颗粒 , 内含多种酶类和糖蛋白. 是一项新兴的生物显微技术 , 是利用荧光物质标记 卵受精之后皮质颗粒与卵质膜融合 , 释放出内含 组织或细胞的某一部分 , 然后用确定波长的入射光 物 , 使透明带和卵质膜成分发生改变 , 阻止多精子 扫描样品不同层面 , 并收集荧光物质被激发出的荧 受精. 某些植物凝集素可以与皮质颗粒中的特异性 光 , 用计算机系统进行分析 , 把各个层面的荧光图 多糖结构相结合[1 ,2 ] . 利用荧光标记的植物凝集素 象叠加起来 , 形成立体 图象. 免疫荧光化学术 抗体 , 并结合激光共聚焦显微术 , 可以有效地示踪 (immunofluorochemistry) 是利用抗原抗体特异性 皮质颗粒的分布及排放情况. 蛋 白激酶 C ( P KC) 反应来研究特定蛋白质在组织 、细胞中表达时间和 是一类丝/ 苏氨酸蛋白激酶 , 在静息细胞中以无活 部位的有用方法. 其基本原理是利用特定蛋白质的 性形式存在于细胞质中 , 当细胞受到刺激后 , P KC 抗体 , 即第一抗体 (first antibody , Ab1) , 使之与 转位到细胞膜上磷酸化多种靶蛋 白. P KC 在卵母 组织切片或整装片 (卵母细胞或早期胚胎) 中的该 细胞 受 精 后 的卵 活 化[3 ] 、皮 质 颗 粒 排 放[4 ] 和 种蛋白质结合 , 然后加入荧光物质标记的抗第一抗 MAP K 激活[5 ] 等过程中都发挥重要作用. P KC 有 体的抗体 , 即第二抗体 ( second antibody , Ab2 ) , 12 种亚型 , 在细胞 中呈现分布和底物特异性[6 ] . 在显微镜下用合适的入射光观察 , 由于抗原抗体 本实验试 图利用小 鼠卵母细胞为实验材料 , 以 的结合是高度专一性的 , 所以只有在具有该种蛋白 P KC 和皮质颗粒为对象 , 研究以卵母细胞为实验 质的部位才可见荧光 , 由此研究蛋白质表达规律. 材料时 , 采用简便而实用的激光共聚焦显微术. 目前已有大量商品