实验须知-天津科技大学.pdf

PART C 酶工程实验 实验十六 层析柱装填及柱效测定 一、实验目的和内容 目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法； 2. 熟悉凝胶层析的一般过程； 3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。 内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填； 2. 凝胶柱柱效测定； 3．凝胶再生的方法。 二、实验仪器和试剂 1. 实验仪器 层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒， 分部收集器，核酸蛋白质检测 仪，记录仪，滴头吸管 2. 实验材料和试剂 Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作 为溶剂） 三、实验步骤 清洗层析柱 测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积 根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量 称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS 在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去 用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出 关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液 （重复使用的填料，从此步开始） 边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降 等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积 待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口 通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min) 始终保护凝胶上端有一段液体 准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切 沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免 将床面凝胶冲起 （参考完成时间11：30） 打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与 胶面相切时，夹紧下口夹子 按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次 加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽 将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相 连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接 起来，设置好基线的位置 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用 0.02mol/L pH8.0 的PBS，以 0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t (记录仪纸速设为 12cm/h，电压 200mv；核酸蛋白监测 r 仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)， 计算单位高度的柱效 （参考完成时间16： 00） 柱效计算公式：N = 5.54•［θ /( W )］2 r 1/2 其中，θr为平均洗脱时间，W 为半峰宽。均为无因次特性值，测量时精 1/2 确到1mm。 [Sephadex G-100每米理论塔板数为3000～6000] 四、注意事项 1. 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2. 装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜 过快，避免因此压紧凝胶。 3. 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体 流干，使