小鼠血虚证造模方法的比较及四物汤的反证.pdfVIP

小鼠血虚证造模方法的比较及四物汤的反证 分子生物实验研究部分 2002207122 岑川 第四组 摘要：目的：观察和比较乙酰苯肼和环磷酰胺两种不同造小鼠血虚模型方法的差异性和检查同一基因在 不同动物模型中的表达差异以及四物汤治疗的效果。实验方法：通过正常组、乙酰苯肼组、环磷酰胺组、 四物汤组这四组组织切片的观察比较来评价血虚造模方法，及通过RT-PCR 法来检测肝组织同一基因的 表达差异。结果：环磷酰胺和乙酰苯肼均有造血虚的作用，四物汤促进血虚证小鼠肝组织基因的表达可 能是其生血作用的机制之一。 关键词： 血虚 环磷酰胺 乙酰苯肼 四物汤 RT-PCR 法 基因表达 近年来 , 随着对血虚证研究的不断深入 ,对血虚证动物模型的研究也有新的进展。尽管动物模型在 当前还不能准确反映人体血虚证的全部实质 ,但作为替代实验对象 , 已在血虚证发病机制探讨及中药治 疗研究等方面发挥了重要作用。乙酰苯肼和环磷酰胺造模都是血虚造模常用的发法，但由于机制不同， 所以有各自不同的特点。 一 实验器材和实验方法 75% 乙醇、氯仿、异丙醇、Trizol、RNAsin(40 Ｕ/u) 、DNTP （10mＭ）、EB （2mg/ml ）、 5*TBE 、琼脂糖、上下游引物、随机引物（100ug ／ul ）、20 ，200 ，1000u 移液枪、电动匀浆机及匀浆 管、冷冻式离心机、离心管、电泳仪、PCR 仪、剪、镊等 正常小鼠组、环磷酰胺造模小鼠组、乙酰苯肼造模小鼠组、四物汤治疗小鼠组各十只 煎药：四物汤（生地. 白芍. 当归. 川芎各 3g) ,共煎成药汁 130ml 灌胃给药：治疗组小鼠每天给药四物汤一次，共七天。前两天每次每只小鼠给药 1ml，后五天每次每 只小鼠给药 0.5ml，其余３组小鼠后四天每只加灌 0.5ml 生理盐水。 RNA 提取 1.取各组实验组任一只小鼠肝组织 50-100mg,剪碎，加入 1mlTorizol 液，快速电动匀浆 2.22 度，静置 5min 3.加入氯仿 0.2ml,颠倒 15s 4.22 度，静置 3min 5.离心：4 度，15000 转/分* 15min 6.取上清液 0.5ml( 含提取的 RNA ） 7.加入适量异丙醇，混匀 8.22 度，静置 10min 9.离心：4 度，15000 转/分* 10min 10.弃上清液 11.加入 1ml4 度 75%乙醇（提纯RNA ，释放异丙醇） 12．离心：４度，10000 转／分* ５min 13．弃上清液，真空干燥５min 14．用25ul 水溶解，－７０度保存 反转录 ５＊ｂｕｆｆｅｒ ４μl ＤＮＴＰ（１０ｍＭ） ２μl 随机引物（１００ｕｇ／μl ） １μl ＤＴＴ（１００ｍＭ） １μl ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／μl ） １μl 总ＲＮＡ（２ｕｇ） 水 至１８μl ６５度，５分钟，冰上，加ＲＮＡｓｉｎ１μl，Ｍ－ＭＬＶ１μl 。３７度６０分钟，９４度５分 钟。－２０度保存。 PCR 白蛋白 葡萄糖醛酸 ＤＮＴＰ（μl ） ２０ ２０ １０＊ｂｕｆｆｅｒ（μl ） ２０ ２０ ＭｇＣｌ２（μl ） ２０ ２０ 上，下游引物各（μl ） ２０ ２０ Ｔａｇ酶（μl ） ２ ２ ＲＴ产物 ４管（０．４μl 每管）４管 加水至（μl ） １００ １００ ＰＣＲ反应条件为：９４°C ３ｍｉｎ－－９４°C ４５ｓ，５５°C １ｍｉｎ，７２°C ４５ｓ，３０个 循环－－７２°