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western显影常见现象、原因及解决方案 近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没 有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案，是 我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的， 其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言 比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。 Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物 敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做 法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗 一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，根据 每次结果调整。 其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以 供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶 带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带 留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为 放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张 片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避 免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可 以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动 了。 在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶 带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以 下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。 现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - -- -- -- 解决 反影( 白色条带,黑色背景) -- -1 HRP过高(背景较高) - - - - - - - - - - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1 显影后膜上条带处变为黄色 - -2 HRP过高(敏感性太高)- - - - - - - - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2 信号弱或无 - - - - - - - - - 3 HRP过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3 - - - - - - - - - - - - - - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - -优化转膜条件*注5 -- - - - - - - - - - - - - - - - - - -6 HRP或底物活性降低 - - -- - - -- - 测试活性或选用敏感底物 *注6 高背景 - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP过高(背景较高) - -- - - - - - - - - - -- 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7 - - - - - - - - - - - - - - - 8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间4度过夜最好*注8 - - - - - - - - - - - - - - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉 - - - - - - - - - -更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9 - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST洗脱不足 - - - - - - - -