γ-丁氨酸对老鼠小脑皮层局部的耗氧量和血流量的调节-溶氧电极.DOC

γ-氨基丁酸对大鼠小脑皮质Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism 2008, 28:906-915 IF= 6.555 摘 要：清醒的大脑，氧气消耗总代谢速率基本保持不变，而在持续活动的区域间存在变化。这表明：与活动相关的控制机理即神经信号，可能会重新分配新陈代以支持主动网络。本研究探讨了γ-氨基丁酸(GABA)受体对大鼠小脑中兴奋型、麸胺酸型爬行纤维—蒲肯野细胞突触受刺激所诱发的小脑氧代谢速率（CeMRO2 ）局部增长的影响。在这个网络中，尽管GABA能受体有变化，但是突触兴奋产生的突触后去极化得以保存。在对照条件下，爬行纤维刺激引起突触活动和CeMRO2的频率依赖性增长。局部应用γ-氨基丁酸A受体激动剂蝇蕈醇阻碍了由突触兴奋引起的CeMRO2增长，并伴随小脑血流量应答的减弱。γ-氨基丁酸A受体拮抗剂荷包牡丹碱可逆转这个效应，也能逆转蝇蕈醇对突触活动和小脑血流量的影响。只应用荷包牡丹碱时，爬行纤维刺激对小脑血流量产生延迟的负脉冲信号，并伴随CeMRO2的长时间上升。结果与假设一致：小脑血流量和CeMRO2的活动依赖性上升是由普通的前馈途径控制的，并且为GABA对CeMRO2和小脑血流量的调节提供了证据。 关键词：小脑；神经代谢藕合；突触传递 材料方法 电生理学记录 我们使用单管的玻璃微电极，充满2M/L的盐溶液（阻抗：2-3欧姆，头部：2微米）。用单个玻璃微电极插入小脑蚓部5或6瓣皮层以下300-600微米深来记录一个单位的活动（脉冲）和蒲肯野细胞胞外局部场电位（LFP）。一个银/氯化银接地电极放到颈部肌肉上。放大的信号（×10）由A/D转换器转换、放大、过滤（脉冲：300-2400Hz带宽；LFP：1-1000Hz带宽），界面记录体统1401+接口与运行2.5型脉冲软件的电脑相连进行数据采样。脉冲数据采样率为20KHz，LFP数据采样绿为5KHz。 图1 记录小脑皮层中脉冲、局部场电位（LPF）、组织氧压和小脑血流量（CBF） 实验计划纲要图展示了激光多普勒血流测定仪探针、刺激和记录电极安置部位。单管电极立体定位于脑部下橄榄体尾部，刺激上行神经纤维，给蒲肯野细胞一个单突触兴奋输入。通过小脑半球LFP应答振幅的手段来优化布置，以便进行连续的低频刺激。玻璃电极记录LFP和单位脉冲活动，另一个微电极以最接近树突/蒲肯野细胞体的水平记录组织氧压。在200-500微米深度定位蒲肯野细胞，通过它们自然激发自然脉冲和复合脉冲的能力来鉴定，或者由电刺下橄榄体5-8毫秒后产生的一个复合电位来判断。LDF通过将探针定位于脑脊软膜上0.3 -0.5毫米，脑脊软膜的传入和传出神经纤维有一250微米的分支，可以下到1.0毫米的深度记录CBF的变化。 爬行纤维刺激 将喷膜、不锈钢两极电极像上面描述的一样放入下橄榄体尾部。这获得了对CFs的一个额外刺激，这通过自发到复合脉冲的变化可以明显看出，这种变化会抑制藓状纤维受刺激而CFs不受刺激时引发的自发脉冲速率的上升。CFs刺激产生一个局部场电位，得到一个经典的层状剖面图和反相图。用小脑蚓体区域LFP时间最长的应答来优化配置，以便持续进行低频刺激（0.5Hz）。用强度为0.15mA、200μs恒定电流的的脉冲来进行持续15s频率为10Hz的刺激。 药物应用 通过局部灌注向小脑蚓体添加药物。用蝇蕈醇激活GABAA受体，用荷包牡丹碱来抑制GABAA受体，每种药物都溶解于人工配置的浓度为0.2mmol/L的CSF溶液中。 小脑皮层血流量测量 LDF探针定位于脑脊软膜无大血管处以上3毫米，来持续记录CBF。探针尽可能靠近微电极和氧电极，刺入1000微米深测CeBF。LDF信号需要0.2秒的时间平稳下来。10Hz抽样率，A/D转换器转换，用2.5脉冲软件记录数据。 组织氧压测量 氧电极置于脑叶中，位置与电生理记录电极和激光多普勒探针相同。用Unisense溶氧微电极（OX-10，Unisense A/S，Denmark）来记录局部组织氧压。小的尖端尺寸（本研究中为3-5μm）确保tpO2的测量结果真实可靠，内置的保护阴极清除了电解液槽中的所有氧气。在进行氧指标的重复性测量时，每个电极都需要在每次实验前后、分别在饱和氧和无氧盐溶液（37℃、0.9%）中进行校正。氧电极与高阻抗的Unisense皮安表相连，用于检测氧电极的电流。信号由A/D转换器转换，以100Hz频率（功率为1401，电压尖峰为2.5）记录。采用0.3Hz低通滤波器进行脱机滤波，以消除心跳和机械通气产生的噪音。 图2 通过增加GABA 能受体来降低小脑皮层耗氧量的诱发上升 （A）实验中，首先添加蝇蕈醇随后添加荷包牡丹碱，记录变量的原始数据（箭头表示开始添加）。上面的图形描绘了蒲肯野细胞的脉冲速率。第