分子生态学实验步骤和原理总结.doc

基因组DNA提取 上海博彩生物科技有限公司：3S DNA Isolation Kit for Environmental Samples V2.2 3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒 V2.2 DNA抽提方法 使用仪器：灭菌锅，无菌操作台，移液枪，漩涡振荡器，台式离心机，水浴锅，分光光度计或者琼脂糖电泳槽 灭菌物品：枪头，1.5ml，2ml离心管 一、污泥样品前处理 样品在处理前首先要混匀，使其中的悬浮物质分布均匀。 取约l0mL污水样品，加入灭菌离心管，400Orpm、离心20min，收集沉淀，加约4倍体积的TENP buffer(50mMTirs，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mL PVP，pHl0)，加玻璃珠(d:l mm)充分匀化(解絮凝)。4000rpm，离心20min，弃上清(重复两次，直至上清液较澄清)。加约4倍体积的PBS buffer(8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于lL水、pH7.4)，旋涡混匀，4000rpm，离心20min，收集沉淀(重复两次) 二、基因组DNA提取 样品准备： 100mg样品用200ul Solution SUS 将样品浸泡、悬浮，使样品软化分散开。 加入400ul Solution LYS，300mg石英砂，盖上离心管盖，在漩涡振荡器上高速剧烈振荡，10-30min或更长时间。 用台式离心机，12000rpm，室温离心5min。 将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中，加入120ul Solution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀。将溶液用1ml TIP全部转移到3S柱内，柱子放入2ml离心管中，不盖离心管盖，室温放置2min以上。 盖上离心管盖，12000rpm，室温离心1min。 取下3S柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入600ul Wash Solution，10000rpm，室温离心1min。 重复6一次。 取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10000rpm，室温离心2min，以除去残留的Wash Solution。 洗脱：在柱子中央加入100ul TE，将柱子放入新的干净1.5ml离心管中，室温放置2min。12000rpm，室温离心1min。收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可以4℃或-20℃保存。为提高洗脱效率，可以将TE预热到37-55℃。如果样品中基因组DNA含量很低，用30ul TE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。重复该洗脱步骤一次，可以提高产率20%左右。 三、提取DNA的质量检测 (1)DNA纯度和浓度检测 用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230，260，280nm处的吸光光度值。 DNA纯度的定性检测: 通过A260/A280及A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。通常纯DNA 样品A26O/A280≈1.8，A260/A2302。若A260/A280l.9，可能有RNA污染；若 A260/A280l.6，可能有蛋白质污染；若A260/A230≤2，可能存在酚类等小分子 杂质。 DNA浓度的计算： 浓度(μg/mL)=A260*50*稀释倍数； 注：1OD值相当于50 μg/mL双螺旋DNA。 (2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳lh，EB染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。 （二）PCR扩增 一、PCR扩增引物 采用两组对大多数细菌和古细菌的16S rRNA基因V3区具有特异性的引物对： 组合(F34，GC和RS:8)。引物组合的正向引物5’端中有一个富含GC的40bp的GC发卡 结构。它们各自序列分别为:F341:(5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’)，Rsls: (5’一ATTACCGCGGCTGCTGG一3，)，GC发卡结构 (5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3’ 组合扩增产物片段长度约为220bp。 二、PCR扩增反应体系 PCR扩增反应体系，与表3一3相同。加样后立即进行PCR扩增。 三、PCR扩增程序 PCR扩增程序，与表3一4相同。 四、PCR产物电泳检测 取5闪PCR产物进行电泳，胶浓度为2.0%，在电压100v条件下电泳lh后检测， 经EB染色后用凝胶成像系统观察，保存凝胶图谱。电泳所用Marker为天根生化 科技(北京)有限公司生产的nNAM叭e:nLZo00。 （三）变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析 预电泳的作用 1.使体系达到反应的条件 2.清除过多的变性剂和APS等，保持胶的稳定状态。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 　　聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜