一步PCR法进行基因片段高效融合.pdfVIP

北方园艺2008(8)：169～171 ·生物技术· 一步PCR法进行基因片段高效融合 陈国梁1’2，苗 娜1，张金文1，王·蒂1 (1．甘肃农业大学农学院，甘肃兰州730070；2．延安大学生命科学学院，陕西延安716000) 摘要：采用一种不需要限制核酸酶和连接酶的方法：一步重叠P(、R法将马铃薯块茎2种淀 粉合成关键酶曲ss和ssⅢ的基因片段融合，该方法在一个P(、R反应体系中通过4个引物2个模 板一次扩增得到一个含有马铃薯块茎2种淀粉合成关键酶曲ss和ssⅢ片段的融合基因gS3。结 果表明：一步重叠PCR法是一种简便、经济、有效的融合基因构建方法。 关键词：重叠P(、R；RN处；基因融合 中图分类号：S I酬A干涉(RN凡一RNAinterference)是由同源性进行独立扩增、分别纯化、回收才能进行融合扩增；一般 dsRNA引起的序列特异性基因沉默现象，在动、植物和要进行两步P(、R反应，延长了试验时间，增加了实验成 真菌中广泛存在并被证实。与反义RNA表达技术以及 本及操作程序等。基于以上现实，采用了重叠PCR一步 基因敲除技术相比，RNA干扰能够强有力地抑制序列 法成功构建了一个含曲ss和ssⅢ基因片段的融合基因 特异的目的基因表达，具有抑制效率高，操作简便、迅速 gs。，用于RNA植物表达载体的构建，由于该方法不需 等优点。其优越性不仅表现在可操作基因的范围和突 要限制性内切核酸酶和连接酶对基因进行酶切、连接及 变的种类扩大了，而且对目的基因的表达有了可控性， 筛选，与传统的融合P(聚技术相比只需要一个PCR反 是一种比反义RNA、共抑制方法更为有效的下调基因表 应就可以得到融合基因，大大缩短了反应所需时间，降 达的技术uj，该技术在研究植物基因功能和改良作物品 低了反应操作难度，方便了融合基因的构建，为基因片 ooO 段重组提供了快速简捷的途径。 质等领域有良好的应用前景。研究表明[2。]以98～l l材料和方法 bp碱基大小为靶标构建的植物dsl酬A的表达载体，均 能产生有效干扰。因此，利用RN～技术静默一个、甚至 1．1菌种和质粒 整个基因家族的多个基因或几个基因家族的基因已不 菌株Ecoli 再是难题[4]，使得用一含有多基因靶位点的RN～载体 Vec— 进行遗传转化获得同时改变多个品质性状的转基因作 种中克隆出的目的基因c【)NA，克隆载体pGEM—T 物成为可能，那么高效、快速多个基因片段的融合技术 tor购自Prorllega公司。 也就成为实现这一设想的关键。 1．2工具酶和试剂 传统的基因片段的重组构建以限制性内切酶和 试验所需的限制性内切酶和而q聚合酶均购自宝 DNA连接酶为基础，通过一系列的酶切连接反应将各 生物工程(大连)有限公司，小量【)NA胶回收试剂盒购 片段逐步连接起来。这种方法费时费力，不但在连接过 自北京博大泰克生物技术公司，抗生素及标准【)NA分 程中引入了不必要的酶切位点碱基序列，而且对于过长 子量Marker购自天为时代公司，其他试剂均为进口或 片段连接有时难以找到合适的酶切位点，过短的片段又 国产分析纯，PCR引物合成和DNA序列测定由上海生 增加了连接和鉴定的难度。为了克服传统的重组构建 物技术有限责任公司完成。试剂均为进口或国产分析 方法的缺陷，出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼 纯，PCR引物合成和DNA序列测定由上海生物技术有 接技术～融合PCR技术。但其在应用过程中还有很多 限责任公司完成。 方面需要改进，如首先必须应用特异性引物，对各片段 1．3引