ELISA方法及基本原理.docxVIP

ELISA的概念、原理、操作步骤 ??ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(?Enzyme-Linked?Immunosorbnent?Assay?)的简称。它是继 免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 (一)原理? ? ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作 用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法(图a) 、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 ?(二)?操作步骤 方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法:? 1.包被：用0.05M?PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。? 2.?加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。? 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。? 4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。? 5.?终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。? 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA 检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。? 方法二：?用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 (三) 试剂器材 1. 试剂： (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO3 1.59g, NaHCO3 2.93g 加蒸馏水至1000ml； (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1g 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 (4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。 (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl (7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。 (9) 正常人血清和阳性对照血清。 2. 器材: (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 (3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。 (四) 注意事项 1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括: (1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、