第4章超薄切片技术.pptVIP

第四章  超薄切片技术;一、生物样品制备技术的重要性;一、生物样品制备技术的重要性;二、TEM样品制备技术分类;1、表面镀金（喷镀）技术 2、组织导电技术 3、冷冻断裂技术 4、离子蚀刻技术 5、临界点干燥技术 6、冷冻干燥技术 7、铸型观察技术（复型） 注： 最基本、最经典的还是超薄切片技术;四、超薄切片技术概述;⑴ 细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应 ⑵ 切片厚度500～700?为宜 ,小于1000 ? 太薄：?高，反差低 太厚：?低，反差好，结构重叠，电子甚至 不 能穿透 ⑶ 切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华 ⑷ 切片能够适当被染色，保证一定的反差 ⑸ 切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他 化学物质的沉淀;取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色;第二节 普通超薄切片技术; 操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤) ⑴ 快：动作迅速,快取,投入固定液 ⑵ 小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4 ⑶ 冷：0～4℃ ⑷ 准：取的部位准，有代表性、目的性 ⑸ 轻：操作轻巧，避免拉、锯、压;⑴动物材料 麻醉→解剖→ 戊二醛预固定（ 0～4℃， 2％～5％） 在预冷的玻板上细切（1mm3） →戊二醛前固定 (1～3h) →漂洗（10～30min） → 1％锇酸后固定 (1～2h) ⑵植物材料 叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡 根茎果实1mm3 ⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块;1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来. 2、常用的固定方法 化学方法：锇酸（OsO4), 戊二醛 （C5H8O2), 甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、 重铬酸钾、丙烯醛 物理方法：冷冻，干燥，高温;⑴ 把细胞中的动态系统定格，要求生命过 程立即停止,细胞和它周围组织中的半液 体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有 机体的生活状态 ⑵ 防止以后的制备过程中丢失或添加成分 ⑶ 使其在电镜下有良好的电子反差;4、固定的标准 细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集 ;1）组成： 固定液：固定剂＋缓冲液 2）作用： ⑴ 破坏细胞的酶活性系统 ⑵ 稳定细胞物质成分，并保存之 ⑶ 接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀 ⑷ 在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型 ⑸ 提供一定的电子反差;1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化 2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶 解、不丢失 3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。 4) 能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定 5) 最好提供一定的反差 ,并有防腐作用;优点： ⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合 ⑵ 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作 用良好 ⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物 ⑷ Z=76，增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好 ;锇酸缺点： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差 ⑵ 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积 ⑹ 有挥发性、剧毒;2）戊二醛（ C5H8O2）; 戊二醛缺点： ⑴ 不保存脂肪 ⑵ 无电子染色作用 ⑶ 对缓冲液的要求严格;双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。;1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液 2、缓冲液主要作用 ⑴ 维持稳定的pH值 ⑵ 提供适当的渗透压 ⑶ 提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀 3、附加剂： 调节渗透压，NaCL, CaCL2，蔗糖，葡萄糖;储备A液(0.2M):磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml 储备B液(0.2M):磷酸二氢钠 (NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml 0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到1