中药对大肠埃希菌抗生素耐药性逆转作用的实验研究教材.pdfVIP

中药对大肠埃希菌抗生素耐药性逆转作用 的实验研究1 1 2 贾云鹏 ，程宁 1 兰州大学基础医学院，兰州（730000 ） 2 兰州大学生殖健康与出生缺陷研究中心，兰州（730000 ） E-mail ：chengn@ 摘 要：目的：探讨三黄汤、黄莲解毒汤和五味消毒饮三种汤剂对ESBLs 阳性E.coli 恢复 对抗生素敏感性的可能性及逆转机制。方法：用纸片扩散法和双纸片协同法筛选产 ESBLs 的E.coli ，用试管二倍稀释法确定三种中药方剂的MIC ，选取低于MIC 的不同浓度在规定 时间下培养耐药E.coli ，测定各中药不同浓度的逆转效果和最佳逆转浓度。提取ESBLs 并测 定酶活性和含量。结果：三黄汤在 0.2g/ml24h ，黄莲解毒汤在 0.1g/ml24h ，五味消毒饮在 0.3g/ml24h 的逆转效果最佳，但与克拉维酸(30µg/ml)比较有显著性差异(p0.05)。 结论：中 药能够通过抑制ESBLs 的活性和减少产量达到逆转细菌耐药性，其作用与中药浓度有关。 关键词：中药，E.coli ，ESBLs ，耐药性逆转 中图分类号：R285；R378.2 文献标示码：A 由于抗生素的广泛使用导致细菌产生了广泛而严重的耐药性, 部分或全部恢复其对抗 生素的敏感性成为当今人们关注的焦点和热点[1]，其中探索中草药对耐药性的逆转作用成为 一种新的途径。本文探讨了三黄汤等三种清热解毒方剂对耐药性大肠埃希菌的逆转效果及其 机制，为研究中草药逆转由 ESBLs 导致的耐药性作用提供实验依据。 1．材料与方法 1.1 菌株 实验菌株收集兰州市某省级医院临床标本中的可疑产 ESBLs 大肠埃希菌，根据美国临 床实验室标准化委员会（CLSI ）推荐的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准，筛 选出 ESBLs 阳性的大肠埃希菌 70 株作为实验菌株 [2] 。 1.2 中药最低抑菌浓度测定 制备三黄汤、黄莲解毒汤及五味消毒饮水煎剂，使三种复方汤剂的终浓度均为 1.0g/ml。 采用试管二倍稀释法，测定三种中药方剂的最低抑菌浓度(MIC)[3] 。 1.3 逆转耐药大肠埃希菌的效果测定 分别将三种中药水煎剂配制成低于最低抑菌浓度的药液共五个梯度浓度，挑取耐药性大 肠埃希菌于各药液中，分别培养18--24小时后，再转移至营养琼脂平板内，继续培养18—24 小时后挑取菌落制成菌悬液，用无菌棉签沾取菌悬液涂布于M-H 固体平板培养基做药敏实 验，抗生素药片选用头孢噻肟（CTX ）和头孢他定（CAZ ）。采用改良Kirby-Baller法[4]，按 美国国立临床实验室标准化委员会(CLSI) 2007年版的规定标准判读结果。 1.4 中药逆转耐药菌的最佳培养浓度 选用低于MIC浓度培养细菌,分别以0.1 g/ml，0.2 g/ml，0.3 g/ml，0.4 g/ml，0.5 g/ ml 三 1本课题得到甘肃省自然科学基金(ZS031-A25-060-E)的资助。 - 1 - 黄汤、黄莲解毒汤及五味消毒饮培养实验菌株24小时，做药敏实验并记录各抑菌圈直径，用 统计软件SPSS11.5方差分析方法处理数据，筛选出不同中药逆转试验菌ESBLs 的最佳浓度。 1.5 超广谱 β- 内酰胺酶活性测定 在 37℃每孔含有210µL 反应液的96 孔板中进行，反应液含有0.01M PBS 60µL、100µg/ml 的CAZ 溶液 60µL、ESBLs 提取液 30µL 和 0.3% H2SO460µL。酶活性单位：在37℃，pH 7.0 时每ml 酶液内每 mg 活性蛋白质每 min 内水解底物的mg 数。 酶活(u)=