dia技术对低丰度蛋白质的非标记定量分析 - waters.pdfVIP

技术简报 DIA技术对低丰度蛋白质 的非标记定量分析 目的 复杂蛋白质混合物的定量分析需要结合胰蛋 使用纳升级LC/MS系统定量分析亚飞摩尔水平 白酶酶解与高重现性、高准确度的蛋白质鉴 的蛋白质 定策略。这一点常常被忽略，因而许多定量 测定都基于错误的鉴定结果。此外，复杂样 品的解析程度也至关重要，因为它决定了我 们可定量的蛋白质的最低丰度。Waters® SYNAPT® G2-S质谱系统在质量数分辨率和准确 度、动态范围和灵敏度等系统性能方面表现 卓越。这些优势有助于实现高度准确的蛋白 质鉴定和蛋白质非标记相对定量，本文将具 体介绍这些内容。 背景 面对越来越复杂的蛋白质组学样品，分析人 员采用同位素标记和非标记蛋白质定量方法 来解决样品定量歧视的难题。这一类研究对 于高分辨LC/MS系统的性能有较高的要求。在 保持样品中蛋白质鉴定的覆盖率的同时，还 E 必须提供最丰富的蛋白质酶解肽段信息，避 图1.牛血清白蛋白的定性LC/MS 鉴定。此为重复进样加入的标准蛋白的鉴定结果， 柱上进样量约为4 fmol 。鉴定所有的肽时，计算得到了1.4 ppm的质量误差。 免定量分析的蛋白质假阳性率(FDR)和错误定 量率(FQR)增加。正因如此，技术改进不可或 缺。本技术简报介绍了SYNAPT G2-S系统，介 解决方案 绍了定量分析加入大肠杆菌(E.coli)复杂细胞 大肠杆菌细胞裂解物中加入不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)、乙醇脱氢酶 裂解物中的标准蛋白的结果。 (ADH)、烯醇酶和糖原磷酸化酶B制品，每个样品重复分析三次。第一个 样品(混合物1)中加标蛋白质的柱上进样量均为500埃摩尔，第二个样品 (混合物2)中加标蛋白质的柱上进样量分别为4000 、500、1000和250埃摩尔。 技术简报 因此，额定的预期比率(混合物2:混合物1)应为 8:1 、1:1、2:1和1:2。采用nanoACQUITY UPLC® 系统 与SYNAPT G2-S联用的方法对肽进行分离和分析， 运行时的质量分辨率为 20k FWHM 。数据在LC/MSE 模式下采集，该模式是一种无歧视的TOF采集方 法，运行时，质谱仪在交替扫描切换低能量和高 F ig ure 2. Relative label-f ree LC-MSE quantif ication and p rofi le rep lication le vel inf ormation f or 能量。采集完成后，处理软件根据色谱保留时间 BSA. Th e exp ected ratio f or BSA is 8: 1, wh ich was accurately determined 将母离子与产物离子关联起来。进一步的关联发 生在数据库有哪些信誉好的足球投注网站过程中，此有哪些信誉好的足球投注网站基于肽CID碎裂时 产生的特异性碎片。采用ProteinLynx Global SERVER™ v.2.5.1，进行定性和定量分析，在种属特异性数 据库中加入标准蛋白的蛋白质序列信息。图1展 示了加入不同浓度标准蛋白样品中的牛血清白蛋 白的LC/MSE定性结果。在本例中，BSA 的柱上进样 E 图2. BSA非标记LC-MS 定量和分析的重复水平信息。BSA的预期比率为8:1，测定结果 量为4 fmol，而大肠杆菌酶解物的量为10 ng。结 非常准确。 果如图2所示，其展示了相应蛋白的相对定量结 果。图3为所有标准蛋白的分析结果。 总结 E 使用SYNAPT G2-S质谱仪，在LC/MS 采集模式下成 功地对加入到复杂生物基质中的四种低至亚飞 摩尔水平的蛋白质标准品进行了非标记相对定 量。测得的所有加标蛋白质比率均在其额定加 标值上下几个百分点的范围内，并且被包括在 报告的95%置信区间中。