DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察.PPT

实验三 DNA的Feulgen染色和细胞有丝分裂相的观察 DNA是主要的遗传物质，主要分布在核的染色质或有丝分裂过程中出现的染色体内。自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。 一、实验目的 1 了解Feulgen反应的基本原理。 2 熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能和操作方法。 3 掌握细胞分裂各期的主要特点。  二、实验原理 DNA经弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性 三、试剂 1. Carnoy固定液 ：3份95%酒精加入1份冰醋酸。 2. 1mol/LHCL ：准确量取86.2ml浓盐酸（比重1.18）加入到93.8ml蒸馏水中。 3. Schiff试剂：称1g碱性品红于200ml煮沸的重蒸馏水中，5分钟后断电使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1N?HCl??20ml，继续冷却至25℃，加入1g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24小时后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入1g活性炭，强烈震荡一分钟，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。 4. 亚硫酸水溶液 (漂白液)：在200ml蒸馏水中，加入10ml?1N?HCl?和10ml??10%偏亚硫酸氢钠水溶液（或1.0g固体）。此液在临用前配制。 否则会因SO2的的逸出而失效。 5. 5%三氯乙酸 6. 0.5%固绿酒精溶液（95%的酒精溶解） 四、实验材料及实验器材 1. 材料 Carnoy液固定的大蒜根尖 洋葱根尖纵切永久制片 马蛔虫卵切片永久制片 2. 实验器材 显微镜、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、 剪刀、冰箱、温箱、天平、载玻片、盖玻片、吸水纸、镜头纸、青霉素瓶、吸管、烧杯、量筒。  五、实验方法和步骤 （一）材料准备??取大蒜若干头，剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。待根尖长1cm时，剪下根尖固定在Carnoy固定液内、保存备用。 （二）水解??实验时，从冰箱取出预先准备好的大蒜根尖，分装到若干个青霉素瓶中，用自来水洗3次，蒸馏水水洗3次，换1mol/L?HCl洗一次，倾去，换入预热60℃的1mol/L HCl?3ml，放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解8-15分钟（视材料而定，水解时间可以从8分钟延长至30分钟）。然后吸去热1mol/L HCl，换入冷1mol/L HCl洗1次，再用蒸馏水将根尖洗3次。 水解是本实验成败的关键之一。重要的是温度，应保持在60±0.5℃之间。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中；反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。 （三）染色??吸净水分，加入Schiff试剂避光染色40min~60min，用漂洗液漂洗2～3次，每次5min,然后经自来水流水冲洗，再用蒸馏水洗2次后准备压片。 （四）压片法??取一根尖置于载玻片上，用刀片切下生长区部位（染成紫红色），加一滴0.1%亮绿水溶液对染一分钟，吸去亮绿液，加一滴清水或45%醋酸水溶液，加盖玻片，用拇指轻压使细胞分散均匀，镜检。 （五）对照组预先用5%三氯醋酸（90℃）处理15min，然后再依次进行实验步骤（二） （三） （四）。 六、有丝分裂各期观察 1 大蒜根尖压片的观察 首先在低倍镜下，区分根尖的分生组织区及延长组织区的细胞，然后，在高倍镜下，观察细胞核的形态，注意在你的片子上，是否有有丝分裂细胞，如有，你能找到细胞分裂期的几个阶段，其特征如何？（可参照附录）  （3）后期：姊妹染色体分别向细胞两极移动，染色体达到两极时染色体紧缩成团，染色体的轮廓逐渐变得不清楚，细胞质中间部位（细胞的赤道板）形成细胞板。 （4）末期：盘绕变粗的染色体又伸展开，此时，核仁、核膜又重新出现。 此外，间期细胞的细胞核有下述特点：核膜清楚，核内结构均匀，除异染色质外，可见1－2个着色较深的核仁。而在进入细胞分裂期的细胞核，一般均大于间期细胞核。 2 洋葱根尖纵切永久制片观察（同大蒜根尖） 3 马蛔虫受精卵切片永久制片观察 马蛔虫是真核生物中染色体数目最少的物种，二倍体马蛔虫的染色体数目为2条或4条，三倍体为6条。在观察切片时要注意所观察卵的染色体数目的不同。 注意 ： 1)