影响梨AFLP技术体系关键因素研究.pdfVIP

安徽农业科学，JournalofAnhuiign．Sci．2008，36(30)：13059，13070 责任编辑 张杨林 责任校对 傅真治 影响梨 AFLP技术体系关键 因素研究 鲁凤娟 ，-，张玉星 (1．河北农业大学，河北保定o710ol；2．中国环境管理干部学院，河北秦皇岛o66oo4) 摘要 探讨了影响梨扩增片段长度 多态性 ( 1JP)技术体系的关键 因素，建立了梨的AFLP标准技术体系，指出DNA的提取、酶的用量和 酶切时间、聚丙烯酰胺凝胶 电泳、银染程序等都对标准技术体系产生不同程度的影响。 关键词 AnP技术体系；关键 因素 中图分类号 $661．2 文献标识码 A 文章编号 0517—66n(2oos)3o一13059—01 StudyontheKeyInfluencingFactorsofPearAFLP TechnicalSystem LUFeng-juanetal (HebeiAgriculturalUniversity，Baoding，Hebei071001) Abstract ThekeyinfluencingfactorsofpearA兀 system werediscussed．PearAFI standardteehniealsystemwasestablished．Itwaspointedout thattheDNA extraction，enzymedosage，enzymedigestiontime，polyacrylamidegeleleetrophoresis，silverdyeprocedureandSOonhaddifferentinflu— encingdegreesonthestna dard teehniealsystem ． Keywords AnP technica1system；Keyfactors 扩增片段长度多态性 (AnP)技术是 20世纪9o年代发 能精确控温，效果较佳。 展起来的一种新型的分子标记技术，它是间隔区扩增(RFLP) 1．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的质量是关键 和基因扩增(PCR)相结合的分析技术，具有稳定、重复性好、 因素(笔者试验使用的丙烯酰胺为13本进 口产品，TEMED和 多态性丰富、DNA用量少等特点llJ。因此，AFLP技术 自问世 甲叉双丙烯酰胺购自Sigma公司)。脲素质量不好不能使样 以来已被广泛应用于生物多样性研究、品种鉴定、分子遗传 品DNA变性，造成带型拖尾，条带模糊分不开。在灌胶时要 图谱构建和基因定位等领域。目前，ALFP技术 已用于多种 避免出现气泡，因为胶中的气泡会使胶面出现凹坑，造成点 作物的研究，如水稻L2j、大麦_3j等。果树上的研究也有报道， 样时渗样或电泳的条带变形。 如猕猴桃 、苹果 55l、枣l6J和香蕉l7J等。但在梨上 国内外 的 1．4 银染程序 在染色过程中，AgN03一定要充分搅匀后再 相关报道还很少。因此 ，笔者对影响梨 A兀P技术体系的关 将玻璃板放人，否则会使银颗粒不均匀潜入胶中，导致背景 键因素进行了研究。 杂乱而影响结果统计。此外，显影时间要掌握好 ，主要带纹 1 影响梨An 技术体系的关键因素 出现后立即定影，时间过长会造成背景加深和一些弱带出 1．1 DNA的提取 在提取 DNA的过程 中，从叶片中提取 现 ，而时间过短会使一些主带不能完全显现出来，两者均会 DNA的方法很多，但梨叶片中富含酚类、多糖、胶类等物质。 影响结果统计。显影液不能过凉，过凉会使显带时间过长， 所以在提取 DNA时，应尽量除去这些物质。提取 DNA时，酚 导致背景过深。另外，在染色过程中冲洗时间过短会造成胶 虽然能有效地使蛋 白质变性 ，但不能完全抑制 RNA酶的活 背景发黄，颜色过深；冲洗时间过长则可能导致 “白板”。 性，而且它还能溶解带有长Poly(A)段的RNA分子 ，使用酚／ 2 梨AFLP技术体系的建立 氯仿(1：1)混合液可解决这一问题。继而用氯仿／异戊醇 2．1 酶切体系 总体积为20 ，包括：DNA(150n