现代生物学试验第四部分——生化样品的制备与分析教案.docVIP

蛋白质实验技术模块教案 教学内容： 蛋白质分离纯化与分析 ： 每2人一组，共18—19组×2,每组5d,5×9=45学时×2。 DNA的制备与分析 ： 每2 人一组,共18~19组×2班,每组2d,2×9×2=36学时。 具体内容： cytc分离一天。 生物大分子制备的原理2学时。 PAGE,PI—PAGE,SDS—PAGE原理2学时。 Sephadex G100等层析原理2学时。 分离物的Sephadex G100纯化,1.5d。 分离,纯化过程中所获阶段样品的SDS—PAGE跟踪及分度分析,1.5d。 纯化物的进一步分析的设想,2学时。 DNA分离纯化原理及注意事项,2学时。 兔肝DNA的分离纯化,1d。 DNA的理化性质分析， 7学时。 教学目的: 模拟生化大分子制备的全过程开展较为系统性的训练。 掌握现代仪器在生化样品制备与分析中的应用及其原理。 掌握两类生物大分子分离纯化,理化性质分析的基本原理及注意事项。 cytc的分离： 实验方法步骤见教学讲义P21。 各步骤的基本目的与要求： 取材——猪心，要求新鲜，cytc未被破坏，含cytc高，材料易得。 加等量0.145mol/l TCA，使cytc从线粒体膜上解聚下来，使呈酸性可溶状态。 过滤——去杂质。 调PH至7.3——以利于（NH4）2SO4沉淀去杂蛋白，缓慢添加。 第二次加（NH4）2SO4的作用是进一步去除杂蛋白，缓慢添加。 两次添加（NH4）2SO4后，cytc仍呈可溶性。 静置过中午或至少2h，目的是解水合，使蛋白质凝聚成絮状，以利于通过离心方法去沉淀。 加入20%TCA（25mol/l上清）——沉淀cytc。 透析——去掉酸，去小分子，为上Sephadex G100作准备。 透析要求：低温，不漏，换透析液，用Ba+方法检查透析的效果。 离心机： 类型：实验室用与工业用，间歇式与连续式，冷冻式与不冷冻式，地面式与桌式，普通离心机和高速离心机与超速离心机，制备式与分析式。 实验室常用离心机： 普通离心机——台式（3000-16000rpm）和地面式（3000-6000rpm），一般不带冷冻设备，由电机和转子所组成，转速由电压调节器调节。 高速冷冻离心机——台式与地面式，18000-25000rpm，0-4℃。 上述+制冷设备及温度检测器。 超速离心机——地面式，达30000rpm，0-4℃。 上述+真空设备及真空检测器。 转子：角式与水平式转子，角式常用于沉降离心，水平式还常用于梯度离心。 离心原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加速颗粒的沉 淀速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度的物质分离开。 F=ω2ω2r。 ω是角速度（弧度/秒）。r是颗粒的旋转半径（厘米） F是任何颗粒所经受的向外离心力。 RCF=ω2r/980, RCF是相对离心力，单位为G；980是地心引力，单位为厘米/秒2。 RCF=⒈119×10－5n2r, n为每分钟的转数。 处于离心管内不同位置的颗粒所受的离心力不同，常以离心管中点至旋转中心距离为r时所得到相对离心图表示为平均离心力。 离心力的计算使不同转速和不同离心半径的离心，统一到相同的离心中去衡量颗粒在离心中所受外加作用力的大小，以利用因不同离心机，不同转子在使用中所选择的离心时间和转速。 离心时间：t= [(㏑r2-㏑r1)/ ω2]/s t为样品颗粒完全沉降到离心管底的时间(秒). S为沉降系数. r2为旋转轴中心到离心管底部的距离(厘米). r1为旋转轴中心到样品液液面的距离(厘米). 5.离心方法: 差速离心法: 定义，应用于沉降系数相差一~几个数量级颗粒的分离。 缺点：a.分离效果差,不能一次得到纯颗粒,经再悬浮和再离心(2~3次),才能得到较纯的颗粒。 b.壁效应严重,在离心管一侧会出现沉淀。 c.颗粒被挤压,可能变形,聚集而失活。 （2）梯度离心： 定义,应用于相差较少(20%或更少)或分子量相差三倍的蛋白质。 优点：a.分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定