耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学 - 化工学报.pdf

第 65 卷 第 7 期 化 工 学 报 Vol.65 No.7 July 2014 2014 年 7 月 CIESC Journal ·2821 · 耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学 1 2 1 2 1 陈杰 ，贾旭 ，于慧敏 ，罗晖 ，沈忠耀 1 2 （清华大学化学工程系生物化工研究所，北京 100084； 北京科技大学生物科学与技术系，北京 100083 ） 摘要：双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过Discovery Studio 2.5 软件对 C-末端盐 桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶 NHaseM-TH-SBM （S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436(+) ）进 行盐桥网络分析，发现其全局盐桥总数有所下降，但双亚基界面间盐桥数量提高到 7 个。在重组大肠杆菌中表达 了原腈水合酶NHaseM-TH （TH ）、盐桥突变酶 NHaseM-TH-SB （SB）和盐桥耦合定点突变的重组酶 NHaseM-TH-SBM （SBM ），研究了 3 种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明，SBM 的腈水合酶活性为 543.9 U ·mg− 1，比 TH 提高了 31.0% ；其米氏方程催化速率常数Kcat 比TH 提高了 20% 。SBM 的表观失活常数KD 在 25～42 ℃范围内 均明显低于对照 TH，在42 ℃时为TH 的 68.0%，显示了良好的热稳定性。SBM 是活性和稳定性同时提高的重组腈 水合酶。 关键词：腈水合酶；末端盐桥；定点突变；反应动力学；米氏方程；失活动力学 DOI ：10.3969/j.issn.0438-1157.2014.07.044 中图分类号：Q 814.9 文献标志码：A 文章编号：0438—1157 （2014 ）07—2821—08 Catalytic kinetics of recombinant nitrile hydratase coupling terminal salt bridge and point-mutation 1 2 1 2 1 CHEN Jie ，JIA Xu ，YU Huimin ，LUO Hui ，SHEN Zhongyao 1 ( Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China ； 2 University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083, China) Abstract