GB/T 18936-2003高致病性禽流感诊断技术.pdf

ICS 11.220 B 41 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 18936-2003 高致病性禽流感诊断技术 Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfluenza 2003一01一10发布 2003一05一01实施 中 华 人 民 共 和 国 发 布 国家质量监督检验检疫总局 GB/T 18936-2003 目9 舀 高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，简称HPAI)是由正猫病毒科流感病毒属中的 A型流感病毒引起的，被世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英),Office Inter- national des Epizooties(法),OIE〕列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。 本标准是参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(200。年版)，并结合我国现有动物卫生法规及农业 部对禽流感的相关政策和措施制定的。 本标准的附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准起草人:唐秀英、李海燕、田国斌。 标准分享网 免费下载 GB/T18936-2003 高致病性禽流感诊断技术 范围 本标准规定了高致病性禽流感(HPAD病毒分离与鉴定技术、血凝(HA)和血梁抑制(HI)试验、琼 脂凝胶免疫扩散(AGID)试验、酶联免疫吸附试验(间接ELISA)的技术要求。 本标准所规定的高致病性禽流感病毒分离与鉴定技术适用于各种禽类高致病性禽流感的病原分离 和鉴定;AGID和间接ELISA适用于A型禽流感病毒的型特异性检验:HA-HI试验适用于禽流感病毒 的血凝素亚型鉴定。 2 病毒分离和鉴定技术 2.1 材料准备 2.1.1病料的采集:死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品，进行分别处理或者同时处理;活禽病 料应包括气管或泄殖腔拭子，尤其是以采集气管拭子更好;小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜 粪便。 2.1.2 病料的保存:病料应放在含有抗菌素的pH值7.0-7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)内(无PBS 可用25%^50%的甘油盐水)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素 (2000IU/mL),链霉素(2mg/ml-)、庆大霉素(50pg/ml-)和制霉菌素(1000IU/ml)，但粪便和泄殖 腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍，加人抗生素后pH值应调至7.0-7.4。在室温放置1h2h后 样品应尽快处理，没有条件的可在4C存放几天，也可于低温条件下保存(-70`C贮存最好)。 2.1.3病料的处理:将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子;粪便、研碎的组织用含抗生素的pH值7.0 -7.4的等渗PBS溶液配成10写^-20%(g/mL)的悬液。样品液经1000r/min离心10min，取上清液 作为接种材料。 22 病毒分离 2.2.1样品接种:取处理好的样品，以0.2ml丫胚的量经尿囊腔途径接种9日龄-11日龄SPF鸡胚， 每个样品接种5个胚，于350C--370C孵化箱内孵育，18h后每8h观察鸡胚死亡情况。 2.2.2 病毒收获:无菌收取18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，阳性反应 说明可能有正薪病毒科的流感病毒;若无血凝活性或血凝价很低，则用尿囊液继续传2代，若仍阴性，则 认为病毒分离阴性 2.3 病毒鉴定 2-3.1A型流感病毒的型特异性鉴定:样品接种鸡胚后，若鸡胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活 性鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)制