IrrE基因酵母双杂交体系诱饵载体构建.docVIP

IrrE基因酵母双杂交体系诱饵载体构建摘要:耐辐射奇球菌中的IrrE基因能增强转IrrE基因油菜的盐胁迫耐受性。为了进一步筛选植物体内与IrrE相互作用蛋白,从而加深对盐胁迫耐受性分子调控网络的认识,根据IrrE基因的开放阅读框设计引物,从PBI121-IrrE上扩增该基因的编码区,将其克隆到酵母表达载体pGBKT7中,获得IrrE的酵母表达载体pGBKT7-IrrE,测序结果表明:pGBKT7-IrrE载体构建成功,可用于后续的酵母双杂交文库的筛选工作。 关键词:IrrE基因;酵母;载体构建 中图分类号: S565.4 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-10-0039-2 0 前言 耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是在极端环境条件下生长的细菌,是Anderson等在1956 年从灭菌处理的肉类中发现的一种非病原性红色球菌,该球菌对电离辐射(存活最高剂量约15kGy,即普通真核生物的1000 倍) 、紫外线、干燥、强氧化剂和一些化学诱变剂显示惊人的抗性。IrrE又名pprI,是耐辐射球菌中发现的一个极其重要的DNA损伤修复的开关基因,它可调节DR细菌中recA 和ppr A基因的表达,而这两个基因编码的重组酶A和辐射诱导蛋白,可能修复电离辐射引起的DNA损伤。IrrE能提高E.coli在氧化、高温、酸性pH、高渗透压胁迫,特别是高盐胁迫下的耐受性;同时在转IrrE油菜中,该基因能引起胁迫应答基因CBF1/CBF3,SOS2,SOS1,SOD上调表达,使转基因植株能耐受高达350mmol/LNaCl的胁迫。在我们的研究中,盐胁迫转基因油菜与野生型油菜相比POD、SOD和CAT三种抗氧化酶的活性都增加,MAD含量比野生型低,同时脯氨酸和可溶性蛋白含量均比野生型油菜的含量高。 酵母双杂交系统是由Fields和Song等人建立的,用于研究真核细胞中蛋白-蛋白相互作用的一种有效方法。本研究将IrrE克隆到酵母表达载体pGBKT7中,获得IrrE的酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-IrrE,为进一步利用酵母双杂交系统筛选拟南芥中与IrrE相互作用的蛋白奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 质粒载体pGBKT7由四川大学遗传实验室惠赠;E.coli JM109菌株由本试验室保存;PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq、DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA Ligase 等均购自TaKaRa公司;质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒及其他生物学试剂等购自成都博瑞克生物技术公司。 1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成 根据NCBI上已公布的IrrE序列设计引物,Prime F:5CCGGAATTCATGTGCCCAGTGCCAACGTCAG3’;PrimeR: 5’CGCGGATCCTACGGCCCGTCCAGTTCACTGTG3’,其中上游引物加EcoR1酶切位点,下游引物加BamH1酶切位点(由上海英俊合成)。 1.2.2 目的基因的扩增 以连接在PBI121上IrrE基因为模板,用PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq 酶扩增IrrE基因。PCR反应按以下体系进行:ddH2Oμl,dNTP4 μl,上下游引物各2μl,模板1μl,PrimeSTAR HS DNA Polymerase Taq酶0.5μl,10×PCR缓冲液5μl;PCR 反应条件为:94℃预变性3 min;94 ℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,32个循环;72℃后延伸10min。 1.2.3 pGBKT7-IrrE的构建 将上述PCR扩增得到的IrrE基因进行胶回收后,用EcoR1和BamH1酶切扩增得到的片段,同时用相同酶酶切载体 pGBKT7,回收目的片段并测定含量,将酶切后的IrrE基因与pGBKT7载体按照摩尔比3:1混合,于16℃过夜连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选阳性克隆。挑取阳性菌落进行培养,提取质粒,采用双酶切和PCR扩增法进行鉴定,PCR鉴定出的阳性克隆再次送上海华大基因有限公司进行测序。 2 结果与分析 2.1 IrrE基因的PCR扩增 利用所设计的引物扩增出IrrE的编码区,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,结果显示扩增片段为1004bp,与预期结果相符合,且无非特异扩增现象(如图1)。 图1 IrrE基因的PCR扩增 注:M为Marker,1为阳性对照,2为阴性对照,3-7为转化的大肠杆菌 2.2 pGBKT7-IrrE载体的鉴定 以T7和Ir