多重pcr检测体系研制的难点dpo引物.pptVIP

多重核酸检测技术——基于DPO引物多重PCR技术的应用研究 Dual Priming Oligonucleotide System （DPO,双启动寡聚核苷酸引物系统） 胡孔新 中国检验检疫科学研究院 卫生检疫研究所 1. 一次性检测多个靶基因、效率高；2.降低实验室成本，节省时间；3.加快检测实验进程。 多重PCR核酸检测体系的优点 要求在同一反应体系中进行多目标特异性扩增，涉及因素复杂，较单一PCR扩增体系，研制过程困难得多：1.不同引物内、引物间的碱基配对干扰；2. 必须考虑引物非特异性结合可能，引物设计长、短要权衡；3.产物片段长度要在电泳检测时可以区分；4.反应体系涉及dNTP浓度、反应体积、变性退火温度、循环次数等因素；5.不同引物扩增效率间的平衡；6.扩增目标越多，条件摸索困难越高。 多重PCR检测体系研制的难点 DPO引物-双启动寡聚核苷酸引物系统 DPO引物的结构 DPO引物由三个部分组成：5’端部分(18-25nt)、3’端部分(6-12nt)以及连接两端的多聚次黄嘌呤(3-8个)。 稳定端 检测端 链接段 多重DPO引物技术背景 DPO引物的优势 1 降低了引物的非特异性扩增 简化了多重PCR体系的优化过程 与普通多重PCR相比，有较高的敏感性 DPO引物技术用于多重PCR设计优势 DPO引物的优点是由其不对称的碱基分布以及次黄嘌呤碱基自身的特点决定的。（传统引物与DPO引物对比） PCR多重体系——具备较宽的退火温度范围 DPO引物与普通引物相比， DPO引物的多重PCR方法对于 退火温度不敏感，即退火温度 在45℃-65℃之间变化时，五对 DPO引物均分别能扩增出目的 条带，且条带的亮度无明显差 异，说明DPO引物系统有一个 较宽的温度适应范围。 DPO引物技术用于多重PCR设计优势 基于DPO引物多重PCR技术的应用研究—— 流感病毒检测方法研究案例 人类感染流感病毒型别、亚型别众多,变异是常态——重点监测工作： A/B，H1N1，pdmH1N1、H3N2，H5N1，H7N9……… 基于DPO引物多重PCR技术的应用检测5种流感病毒 文献引物的设计-----PolyI多少（3-8）合适？ DPO引物设计 ① I碱基的个数：0-8个； ② I碱基的位置： 易变异的区域，易错配 及形成二聚体的区域。 ③ 根据五种病毒的目的基 因序列，利用引物设计 软件，分别设计了五种 病毒的DPO引物(I碱 基的个数为3-8个)。 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxI……..-3’ 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx II……..-3’ 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxIII……..-3’ 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx IIII……..-3’ 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxIIIII……..-3’ 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxxx IIIIII……..-3’ 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxxxIIIIIII……..-3’ 5’-xxxxxxxxxxxxxxxxxx IIIIIIII……..-3’ polyI添加模式图 x代表引物5’端碱基，一般为16-25nt； . 代表引物3‘端碱基，一般为6-12nt； I 代表次黄嘌呤碱基，一般为3-8个。 引物的设计-----PolyI多少是合适的？ 系列单引物扩增示例： PolyI=5 条件优化-----退火温度、引物浓度 退火温度：A/B/C/D=45/50/55/60 灵敏度测试-----系列稀释的DNA模板 特异性测试-----混合引物对单一病毒检测及咽拭子样品 流感病毒常用的检测方法：1.普通PCR;——成本较低，便于序列分析和分辨亚型；2. Real-time RT-PCR方法；——敏感性高，不易污染；3. ICT(胶体金免疫层析试纸条）——现场，快速，不能区分亚型。 实际样品测试-----与现有常用流感病毒检测方法比较 130家参加流感、登革病毒检测能力验证实验室均采用了荧光定量RT-PCR方法， 流感、登革病毒检测能力验证——荧光定量PCR方法 实际样品测试-----与现有常用流感病毒检测方法比较结果 敏感性最高的Real-Time RT-PCR方法 速度最快的方法 Real-time PCR与DPO 多重PCR方法检测病例数比较 DPO方法与Real-time PCR ct值相关性 与目前敏感性最高的Real-Time RT-PCR方法： 一般可以检测CT30的样品 多重DPO-RT-PCR防污染阳性模板制备-