itc 应用于强力结合及特弱结合的亲和力测定.pdfVIP

GE Healthcare Life Sciences ITC 應用於強力結合及特弱結合的親和力測定 競爭式測量法  強力之結合親和力測定 -9 -2 ITC 可直接測定之解離常數(K ) 的範圍為10 ~10 M 。如為更強之結合 D (K 10-9 M) 的情況 ，結合滴定曲線於結合等量點將成垂直 ，而無法正確地計算 D -9 K (1) (圖1-1) 。最近 ，Sigurskjold 等人提出了10 M 以下的K 測定方法(2) 。這個 D D 方法將採用兩種配體(Ligand) 。其中之一是具備強大結合力的配體A 。而對於同一 結合位置而言 ，另一種配體B 則比配體A 的親和力低 ，而與配體A 產生競爭性 的作用。首先一開始 ，將配體B滴定於蛋白質溶液 ，並求其K 與ΔH （圖1-2 ）。 D 在下一個實驗裡 ，將配體A滴定於蛋白質與配體B的混合溶液中 ，並將配體B置換 為配體A （圖1-3 ）。採用合適的曲線擬合模型 ，計算可強力結合之配體A的解離 常數(2) 。Velazquez-Campoy 等人利用這種方法 ，進行了HIV-1 蛋白酶與其強力 的抑制劑的研究(3) 。 1-1 將生物高分子裝填於樣本槽 ，以滴 1-2 將生物高分子裝填於樣本槽 ，以 1-3 將生物高分子與配體B 的混合 定用的滴管裝填可牢固結合的配體A 滴定用滴管裝填結合力弱的配體B 以 溶液裝填於樣本槽 ，以滴定用的滴 以進行滴定的情形。滴定曲線不會成為S 進行滴定 。 管裝填配體A 以進行滴定。於進行 型曲線狀 ，此時無法決定配體A 的KD 滴定的過程當中，配體B 將被配體A 值 。 置換。從Sigurskjold(2)的模型可求得 A 的KD 。 圖1 ：結合力強的典型 ITC競爭結合實驗數據