Western blot全攻略 - 生物秀知道.PDF

生物秀-专心做生物！ Western Blotting 全攻略 Western Blotting 全攻略 蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting ）一般由凝胶电泳、样品的印迹和 免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质 按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物 上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转 移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已 m 经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间 o c 接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶 . （AP ）或辣根过氧化物酶（HRP ）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显 e 色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于 o 蛋白表达水平的检测中。 一、基本原理 i 第一部分：SDS电泳 b e 1、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷， . 为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样 物 缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠 生 w （CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的 易 w 氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸 w 残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质 充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外 样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适 量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上 样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动 凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样 品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。 2、电泳启动时，蛋白样品处于 PH6.8 的上层，PH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下 ¯ ¯ 槽为正极。出现了 PH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时 Cl 解离度大，Pro 解离度居中， ¯