哺乳动物胚胎工程技术.PDF

哺乳动物胚胎工程技术 • 实验内容： 1、小鼠卵母细胞的收集； 2、小鼠卵母细胞的体外成熟； 3、小鼠卵母细胞的体外受精； 4、小鼠早期胚胎细胞的体外培 养及活体观察。 • 实验目的： 1、学习和掌握哺乳动物卵母细胞的收集、 体外成熟和体外受精技术； 2、学习和掌握小鼠早期胚胎细胞体外培养 技术； 3、通过早期胚胎细胞体外培养技术的实验 操作，以及在体外观察不同发育阶段胚胎 细胞的形态变化，以对哺乳动物早期胚胎 发育阶段和细胞形态特征有一直观的认识， 为进行胚胎工程研究建立技术基础。 实 验 原 理 • 小鼠是一种常用的哺乳实 验动物，它经济实用，取 材方便，是对哺乳动物生 殖细胞发生、体外受精和 胚胎发育进行基础研究的 理想材料。 一、卵子的发生 • 哺乳动物卵子的发生在卵 巢内进行。 实 验 原 理 • 卵子的发生可分为3个时期： （1）增殖期：卵原细胞进行有 丝分裂。 （2）生长期：卵原细胞进入第 一次减数分裂而变为初级卵 母细胞，并在排卵前停滞于 第一次减数分裂的前期。 • 初级卵母细胞的核特别大， 充满核液，看起来很象泡状， 因此称此时的卵母细胞核为 生发泡 （germinal vesicle, GV），此时的卵母细胞称为 生发泡 （GV）期卵母细胞。 实 验 原 理 （3）成熟期：卵母细胞的成熟 是指停滞在第一次减数分裂 前期的初级卵母细胞苏醒 （激素刺激），接着完成第 一次减数分裂（生发泡破裂， GVBD）、排出第一极体，并 进入第二次减数分裂变为次 级卵母细胞的过程。 • 卵母细胞成熟的标 是排放 出第一极体。 • 哺乳动物卵母细胞成熟后又 停滞在第二次减数分裂的中 期（MII期），此时的卵母细 胞称MII期卵母细胞。 • MII期卵母细胞只有受精或人 为激活后才完成第二次减数 分裂。 实 验 原 理 • 成熟的MII期卵母细胞自 卵巢排卵进入到输卵管。 • 小鼠卵母细胞的体内成熟 的时间已掌握，可从输卵 管中收集MII期卵母细胞。 • 亦可收集卵巢内的GV期卵 母细胞，在体外培养条件 下进行体外成熟 （in vitro maturation, IVM）。 实 验 原 理 • 卵母细胞（GV期卵母细胞， MII期卵母细胞）不是独 立存在、发育的。 • 卵母细胞与周围的卵丘 （颗粒）细胞一起构成卵 丘-卵母细胞复合体； • 形成的囊泡称为卵泡。 • 当精子与MII期卵母细胞 结合受精后，卵丘 （颗粒） 细胞解离。 实 验 原 理 • 卵母细胞和早期 胚胎的外周包有 一层厚薄均匀的 透明带。 • 第一极体和第二 极体都在透明带 内。 实 验 原 理 • 自然情况下哺乳动物排放的 卵母细胞数量很少。 • 为了获得更多的卵母细胞或 胚胎，人们模拟机体内卵母 细胞发育、成熟与排放的激 素调节模式，通过注射不同 的促性腺激素，刺激暂时处 于休止状态的卵母细胞进入 成熟发育期，成熟后排放于 输卵管，由此可以获得比自 然排卵多得多的卵母细胞或 胚胎，这一过程称为超数排 卵。 实 验 原 理 • 孕马血清促性腺激素