一、实验材料.PDF

RT-PCR 一、实验材料 1 试剂与耗材 1.1.1 TRIzol 1.1.2 cDNA第一链合成试剂盒 1.1.3 Taq DNA Polymerase 1.1.4 Agarose 1.1.5 50×TAE 电泳缓冲液 1.1.6 氯仿 1.1.7异丙醇 1.1.8 70%乙醇（DEPC处理） 1.1.9 0.1% DEPC Water 1.2.10 TE缓冲液（pH 8.0） 1.1.11 内参与目的基因引物 2 仪器与设备 1.2.1立式压力锅 1.2.2电热鼓风干燥箱 1.2.3分析天平 1.2.4超净工作台 1.2.5台式低速离心机 1.2.6通风橱 1.2.7涡旋振荡器 1.2.8高速冷冻离心机 1.2.9紫外光度仪 1.2.10普通梯度PCR仪 1.2. 核酸电泳仪 1.2.12凝胶成像仪 1.2.13移液器 二、实验方法 1 RNA提取 1.1.1组织样本：取约30~50mg组织样本与冰冷的组织匀浆器中，加入1ml预冷的 TRIzol ，冰上研磨至无颗粒透明装溶液； 1.1.2细胞样品：取约1X107细胞于冰冷的组织匀浆器中，加入1ml预冷的TRIzol ，用1ml蓝色 枪头冰上吹打至无颗粒透明装溶液； 1.2将上述充分裂解的细胞液转移至1.5ml离心管中，在室温下放置5min，使得 核酸蛋白复合物完全分离； 1.3加入氯仿（每使用1ml TRIzol加0.2ml氯仿），盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s，溶液呈乳白状，无 分层现象，室温静置3min ； 1.4 2,000g ，4 ℃离心15min； 1.5取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下 层有机相； 1.6小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相体积约为所用Trizol试剂的60 ％； 1.7向得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；12,000 g，4 ℃离心10min； 1.8小心去除上清，缓慢沿管壁加入1ml 70 ％的乙醇（用DEPC处理过的水配制），轻轻混匀； 1.9 12,000g，4 ℃离心10min； 1.10小心吸尽上清，室温干燥沉淀5min左右，适量而定（不可晾得太干，否则R NA将会很难溶解），加入30~50 μL 的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后 于-70℃保存。 2 RNA浓度和纯度的测定 2.1取5μL DNA样品到495μL 1×TE Buffer 中，测定样品在260nm和280 nm 的吸收值。OD260在0.1-0.9之间比较好,说明OD260/280数值比较可靠。 2.2 RNA 的浓度＝OD260 ×稀释倍数×0.04 μg/ μL （比色皿光径1cm）。 2.3 RNA纯度的判断根据OD260/OD280 的比值判断，符合要求纯度高的纯化RNA其 OD260/OD280在1.8- 2.0之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中有RNA 降解 。 3 cDNA第一链合成（20μL体系）： 3.1 使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s ； 3.2 取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入如下组份： RNA （2μg ） n μL Oligo dT （18）(50μM) 2 μL 无核酸酶的双蒸水至总体积 12.5 μL 3.3 65℃保温5min，然后冰浴5min； 3.4 往上步骤中的0.2ml PCR管依次加入如下组份： RNase抑制剂(40u/μL) 0.5 μL 5×Reaction Buffer 4.0 μL dNTPs(10mM) 2.0 uL M-MuLV 1.0 μL 3.5 轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s ； 3.6 先在42℃保温1 h ，然后70℃保温10min,然后置于冰上5min； 3.7 上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。 4 RT-PCR预实验 4.1为保证样品的可靠性，对反转录好的cDNA稀释5倍后，进行预实验； 4.2 取灭过菌且无核酸酶的0.2ml离心管，在冰上依次加入如下组份： 10×Taq Buffer 5μL MgCl2(25mM) 4μL