与DNA的杂交.PPT

基因芯片技术是建立在Southern blot基础之上的，可以说它是Southern blot的改进和发展，它的原理是：变性DNA 加入探针后在一定温度下退火，同源片段之间通过碱基互补形成双链杂交分子。 与Southern blot相比较，基因芯片具有高密度、高通量、并行性、微量化、自动化的特点。 用于基因功能的研究。原理：用不同的荧光染料通过RT-PCR标记不同来源的细胞mRNA制备成探针，将探针混合后与芯片上的基因杂交、洗涤、扫描，得到这些基因在不同组织或个体中的表达谱，再通过计算机分析这些基因在不同组织或个体中的表达差异，得出这些基因表达的重要信息。即： （1）高表达 （2）低表达或不表达 1. 表达谱基因芯片 HBV、HCV、结核杆菌等病原体检测，商检等。 2.诊断芯片 在DNA 和/或RNA水平上用于疾病诊断， 如肝癌、糖尿病等。 3.检测芯片 六、单核苷酸多态性分析技术 ?单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP) 是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。 同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，主要表现为基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性 。 SNP的特征 SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP. 因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。 SNP的检测方法 1.传统经典法 基于凝胶电泳为基础 检测速度慢、灵敏度低、效率低 2.高通量检测法 主要有DNA芯片技术、变性高效液相色谱、DNA测序技术、飞行质谱仪检测 快速、高效、高通量、微型化、自动化 七、应用评价 1.恶性血液病基因分型及预后判断 bcr/abl融合基因：CML PML-RARa融合基因：APL AML1/ETO融合基因：AML-M2 应用评价 2.免疫球蛋白重链（IgH）基因和T细胞受体(TCR)基因重排的检测 3.遗传性血液病的诊断 4.HLA基因多态性检测 5.肿瘤细胞多药耐药基因的检测 6.基因治疗 第七节 流式细胞分析 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 流式细胞仪的特点 单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞或微粒 流路 (液流系统） 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml 光路（光学系统） 光源 滤片 电路（检测系统） 光电倍增管PMT 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计 （分析系统） 计算机 构造及工作原理 流动室 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 液流系统 常用荧光染料介绍 FITC： 绿色 525nm PE： 橙黄色 575nm ECD： 橙红色 610nm PE－CY5： 深红色 675nm PerCP： 深红色 675nm PE－CY7： 深红色 755nm 7AAD： 深红色 675nm PI(碘化丙啶）： 橙红色 620nm 488nm波长的氩离子激光激发 信 号 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5 光学系统 散射光信号 —— 细胞大小及颗粒性 FS SS 光学系统 结果