分子生物学课件之DNA复制2.pptVIP

* 第三节：Eukaryotic DNA replication 一、复制起点与起始 真核生物的DNA复制发生在S期。在真核生物的基因组中，并非所有的复制子都同时进行DNA复制,而是按一定的顺序分批进行。构成常染色质的DNA在S期的早期复制，异染色质DNA主要在S期晚期复制，着丝粒DNA和端粒DNA复制时间最晚。现在尚不清楚控制复制早迟的分子机制。 在真核生物中复制起始区有没有特殊序列呢？同研究大肠杆菌oriC序列的一样，通过把酿酒酵母基因组DNA片断插入到无复制功能的质粒中，发现了能够使重组DNA分子在酵母中自主复制的酵母基因组顺序，称为自主复制顺序（autonomously replicating sequences）或叫ARS元件。在一个～180 bp的ARS（ARS1）中鉴定出了一个复制起始必需元件，即15 bp的元件A,和另外三个能够提高起始效率的短片断，分别称为B1、B2和B3。比较一下酵母中多种ARS元件可发现有11bp的保守顺序 [A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T]。A和B1是由6个蛋白质亚基构成的起始识别复合物（origin recognition complex，ORC）的结合部位。一旦被CDKs激活，ORC允许DNA双链打开，为DNA聚合酶提供模板。 在细胞周期中，S期与M期必须协调，以保证基因组在有丝分裂前完全复制并且只复制一次。分裂末期，ORC以及其他蛋白质成分在ARS处装配成复制前复合物（pre-replication complex, pre-RC）。当细胞通过了R点或START点，S phase-promoting kinases(SPK: Cdc7/Dbf4 and cyclin E-Cdk)的活性迅速升高，使pre-RC转化为有活性的复制复合物。高水平的Cdk活性从S期开始一直延续到中期结束，并且阻止pre-RC的装配。在末期，Cdk的着这两种活性均被破坏，pre-PC被允许重新装配。 二. Replication forks SV40的DNA为一5 Kb的双链环状DNA，进入细胞核后会形成核小体。SV40 DNA为研究哺乳动物的复制叉提供了非常好的模型。与大肠杆菌的复制起始过程一样，SV40 DNA的复制也发生在一个特定的位点上。病毒编码的T抗原是一种位点专一性DNA结合蛋白，它与SV40 DNA的复制起点结合，利用解旋酶活性局部打开DNA双螺旋。DNA双螺旋的打开还需要ATP和复制蛋白A（replication protein A, RPA）的参与，RPA实际上是一种宿主细胞编码的单链结合蛋白。 在真核细胞中，引发酶与DNA聚合酶α形成一个复合物，这个复合物在复制起点与单链模板结合，并合成大约10个核苷酸长的RNA引物。接着，RNA引物要被DNA聚合酶α延伸一小段距离。 因为DNA Polα/引物酶的延伸能力相对较低，很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代。聚会酶δ或聚合酶ε取代DNA Polα/引物酶的过程称作聚合酶切换（polymerase switching）。发生聚合酶切换时，细胞复制C（replication factor C, RFC）结合到延长的引物上，催化装配由增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)构成的滑动夹子在模板－接头上的组装，然后DNA聚合酶δ（polδ）结合到PCNA上并最终完成冈崎片段的合成，所以RFC是一种夹子装载因子（clamp-loading factor）。当遇到原先已形成的冈崎片段5`末端时，polδ/PCNA复合物从DNA上释放下来。 复制蛋白A（RPA） 后随链模板 聚合酶?/引发酶 A B C D E F G PCNA 复制因子C（RCF） 聚合酶? RNA引物 RNaseH/FEN1 冈崎片段 图12-4 参与真核DNA复制的酶及蛋白因子(前导链未标明) 引物的去除通过两个步骤，首先由RNase H降解大部分RNA引物。由于RNase H断裂两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，因此会留下单个核糖核苷酸连接到冈崎片段上。最后一个核糖核苷酸则由側翼内切核酸酶（flap endonucleae 1, FEN1）除去。FEN1也能除去由于DNA聚合酶δ产生的某些错误的碱基。DNA连接酶将相邻的两个DNA片段连接起来，形成大分子DNA链。 三、Telomere replication 对于线形DNA分子来说，后随链的半不连续合成并不能复制后随链模板的3’末端。新的冈崎片断引物的合成位置通常距上一个冈崎片断200 bp。如果必威体育精装版合成的冈崎片断的5’末端距模板的3’末端不足200 bp，那么就没有足够的空间引发另一次合成，这样后随链的最后一