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分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报 第 6 期 第 37 卷 Chinese Joumal of Analytical Chemistry 897 问 901 2009 年 6 月 循环连续流动分析法测定跺根过氧化物酶的活性 恒1 方圆1 魏然飞I 商秀峰2 ~恶永生 .1 I (四川大学化学工程学院，成都 61∞6S) 2( 四川大学华商基础医学与法阪学院，成都 610041 ) 摘 要 基于日2 02-辣根过氧化物酶(HRP) -邻笨二胶(OPDA) 催化反应体系，建立了测定游离及固定化 HRP 酶惰性的循环连续流动分析法(CCFA) 0 CCFA 实现了反应液、反应过程的循环连续检测。用 CCFA 法对酶 催化反应条件进行研究，得到的最倏反应条件是:pH 5.0 ，反应损度 27 t, 66.0μmoνL H20 2 , 2 mglL OPDA ，缓冲液为 0.1 moVL 拧橡酸·拧橡酸锅缓冲液;测定游离 HRP 的线性范围为0-10 U/L，检出限为0.21 U/L ，民5D 1. 039岛。使用 CCFA 法测定了固定化 HRP 的活性，并对 HRP 酶促动力学进行了研究，得到的游离 HRP 的米氏常数为0.078 mmoνL，最大反应速度为0.26 IDIDOν(L IDin) ，催化常数为5.2 x 10min-o CCFA 法操作简便、准确度高、节省试剂、易于实现自动化。 关键词 循环连续流动分析，辣根过氧化物酶，活伎 1 引 同 吉 棘根过氧化物酶(HRP) 是…种广泛用于酶免疫分析的标记物，其洒性的测定在临床免疲学、l 临床 疾病珍晰及动植物培养上均具有囊要意义[ljo 目前，测定 HRP 活性的常用方法有比色法[2] 、分光光庶 法[3 圳、荧光光度法[S ， 6] 及电化学法[7 ， 8J 等，这些方法多为手工操作，存在着过程烦琐、误差大、试剂消辑 多等缺点。近年来，由于固定化 HRP 生物反应器在工业催化、有机合成等行业具备高度专…性、高催化 效率、稳定性高于水揭穿酶及可长期反复使用等优点阳具有较高的结济效益，在很多领域得到迅速发展和 应用[9] 。倒是，HRP 捕性测定方法大多娃针对游离恋的 HRP[6] ，关于朋定化的 HRP 括性测定及动力学 研究报道很少。 Bayramoglu 等[叫采用手工分光光度法测定了游离 HRP 和固定化 HRP 的活性和动力学 参数。 Melgarejo [11 J 和 Vojinovic [12] 等基于循环流动分光法测定了填充床固定化 HRP 的动力学参数，实 现了对固定化酶性能简便、准确的测定。本研究将文献[υ12幻]中的流路与带循环流动垃射分析法[川ω叫]相销 合，开发了…种能顺F序萨测定游商酶和剧2商运化脚性能的循环f迹辈鳞流动分析怯(circulating continuous flow 自幽. 0 an协叫吻all忖y归si灼s ， CCFA) ;井慕于 HRP 催化 H盹2 2-0 叽 HRP 活性的!顺帧序进行了测定。 2 实验部分 2.1 IU Æ:原理 在 HRP 的催化作用下，H 0 辄化邻苯工脐(OPDA) ，反应生戚 2 ， 3