利用SSH方法分离早期发育相关基因片段.PDFVIP

利用 SSH 方法分离早期发育相关基因片段! 郁卫东 1） 梁蓉 2） 杨丽君 2） 郭静竹 2）** 1) 2) ( 北京大学人民医院中心实验室 北京 100044， 北京大学人民医院儿科 北京 100044) 摘要 目的： 分离和鉴定与小鼠合子基因组激活（ZGA ）以及母源调控向胚胎调控（MZT ）过渡事件相关的 基因片段，为进一步认识 ZGA 和 MZT 发生的分子机制奠定基础。方法 利用单个植入前胚胎抑制性消减杂交 （SPE-SSH ）的方法，对单个小鼠M Ⅱ卵母细胞和 2-细胞期胚胎进行双向消减杂交；利用 cDNA array 对获 得的基因片段作进一步的鉴定。结果： 从构建的消减杂交库中随机挑取得 31 个克隆，经 cDNA array 鉴定 发现其中有 5 个 M Ⅱ期特异表达的基因片段和 9 个 2-细胞期特异表达的基因片段，Genbank 检索发现其中 10 个片段是首次报道在植入前发育阶段表达。结论： 这些基因片段具有明显的期特异性表达的特点，可 能在 ZGA、MZT 和胚胎植入前发育过程中起着重要的作用。 关键词 合子基因组激活，MZT，早期胚胎发育，单胚胎抑制性消减杂交，cDNA array 哺乳动物的胚胎发育始于受精时雌雄配子的融合，此时的配子在转录上处于缄默状态。 早期的胚胎发育由卵母细胞中母源遗传因子所控制。母源调控向合子型调控的过渡 （Maternal-zygotic transition, MZT）发生在受精后头几天的卵裂期间，此时贮存转录本 已经逐渐耗竭，取而代之的是新转录本的合成，即合子基因组的激活（Zygote Genome Activation, ZGA）产物[1]。 母源因子对胚胎早期发育的调控具有严格的时间特异性，这样有利于精子和卵子染色质 结构的活化，从而能够使转录因子更方便的接近转录位点[2]。在 1-细胞期末,核内转录因子 的浓度升高[3]，细胞核首先获得进行基础转录活动的能力[4-6]，此时亲本染色质的转录活化 结构是开放性的，转录活动不需要增强子的参与[7]。但是在第一次有丝分裂结束之后，转录 活化结构上开始出现抑制性结构，同时转录活动也必须要有增强子的参与[8]。2 细胞期以后 的胚胎在转录活化上获得了增强子远距离对其启动子的激活能力[9]，这是胚胎进一步发育时 主体转录活动所必需的。这样的结果就是首先解除对染色质的抑制，使其结构得到功能性的 活化，其次依赖于母源因子的蛋白质合成发生量和质的显著改变[10]。那么，此时胚胎的发育 完全依赖于自身合子基因组的激活。 为了分离母源和合子特异性的发育相关基因，我们利用单个植入前胚胎的削减杂交技术 构建了 M Ⅱ卵母细胞和 2 细胞胚胎的削减杂交文库[11]。对一些特异性表达片段 的随机分析表 明它们可能在 ZGA，MZT 和早期发育过程 中起着重要的作用，对这些基因深入细致的功能分 析更有助于阐明哺乳动物胚胎早期发育的分子机制。 1． 材料和方法 1． 1 材料 6-8 周龄的雌性 Balb/C 小鼠 由北京大学人民医院实验动物中心提供； PMSG 由天津市华 孚高新生物技术公司生产；hCG 由上海第一生化药业公司生产；透明质酸酶和 dNTPs 购 自 Sigma 公司；Superscrip Ⅱ逆转录酶购 自 Invitrogen 公司； RNasin RNase 抑制剂购 自 Promega 公司；PCR Select Kit 和 cDNA Smart Amplification Kit 购 自 Clontech 公司； 收稿日期 : 接受 日期 : *国家重大基础研究发展规划项目 （973）（编号：2001CB510303） **通讯联系人 Tel: 010 E-mail: gjzhxx@ 第一作者：郁卫东，男，1969 年 4 月 3 日，2003 年获得中科院遗传与发育所理学博士学位，2004 年完成在北京大学临床医学博 士后工作，现职称为助理研究员 Dyneal-Bead mRNA Kit 购 自 Dyneal 公司；Taq DNA 聚合酶、pGEM-T 载体、X-Gal 和 IPTG 购 自Promega 公司；T7 AmpliscribeTM Kit 购 自Epicentre 公司；反 向 Nor