基因工程1.doc

基因工程资料 基因工程是将DNA片段插入到质粒、病毒等载体中，形成遗传物质的新组合，然后，转移到宿主细胞中扩增和表达。它包括重组DNA技术、体外DNA突变、体内基因操作以及基因的化学合成等；总之，凡是在基因水平上操作并改变生物遗传性的技术工程统称之为基因工程。 基因工程的理论依据 不同基因具有相同的物质基础； 基因是可切割的； 基因是可转移的； 多肽与基因之间存在对应关系； 遗传密码是通用的； 基因可通过复制把遗传自信传递给下一代。 理论上的三大发现 1.Avery于1934年首次报导了肺炎球菌的转化转化实验；10年后，才公开发表。 2.Watson Crick 提出了DNA结构的双螺旋模型； 3.60年代破译了遗传密码，确定了遗传信息的传递方式。 技术上的三大发明 1970年，在流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中分离纯化了限制性核酸内切酶，为基因工程的诞生奠定了最为重要的技术基础； 1970年，Baltimore和Temin等发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。 1973年，Cohen将质粒作为基因工程的载体使用，这是基因工程诞生的第二个技术准备； 基因工程的操作包含以下步骤： 1.获得目的基因 2.构造重组 DNA 分子 3.转化或转染 4.表达 5.蛋白质产物的分离纯化 简述基因工程的应用。 基因文库，系指在一种载体分子中随机地克隆着某种生物、组织、器官或细胞类型的所有的DNA片段而构成的克隆集合体。 用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。 比较： 基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。 cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 构建步骤： 1.分离细胞总RNA，然后从中纯化出poly(A) RNA 2.mRNA的分离 3.合成第一链cDNA 4.合成双链cDNA分子 置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。目前合成cDNA常采用该方法。 自身引导法 合成的单链cDNA 3端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用 5.将合成的双链cDNA分子重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入到大肠杆菌细胞增殖。 核酸杂交（nucleic acid hybridization），它是指两个互补或部分互补的核酸分子形成稳定的碱基配对杂交体的过程。 印迹法（blot）的主要步骤：（1）DNA 用限制性内切酶处理。 （2）DNA 片段混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片段DNA 作为探针，互补结合需要找的基因片段。（5）探针DNA 片段已用放射性元素标记， 使胶片感光后可看出。 随机引物（random primer）随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的且带有标记物的DNA探针。 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从5→3的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷