川牛膝CoObgC基因克隆、亚细胞定位及表达分析お.docVIP

川牛膝CoObgC基因克隆、亚细胞定位及表达分析?お? 　　[摘要]根据川牛膝基因组数据提供的基因序列合成特异性引物，利用常规PCR方法和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆川牛膝ObgC（GeneBank登录号KU84.7910）全长cDNA序列，克隆获得2 2.2.6 bp全长CoObgC序列，开放阅读框为1 81.8 bp，编码605个氨基酸序列，预测CoObgC蛋白相对分子质量为663.9 kDa，等电点pI 5.3.5，为稳定蛋白，并进行多重序列比对和构建系统进化树分析。以川牛膝actin为内参，采用实时荧光定量PCR（qRTPCR）分析CoObgC基因在川牛膝根、茎、叶、花4种组织中表达特征，结果显示在叶片中表达丰度最高，其次为根、花、茎；构建pCABIA2.300CoObgC重组载体，利用农杆菌介导法在烟草中进行瞬时表达，激光扫描共聚焦显微镜观察显示川牛膝CoObgC定位于叶绿体。该研究为进一步解析Obg基因的结构和功能，开展川牛膝分子生物学研究奠定基础 [关键词]川牛膝； ObgC； 基因克隆； 亚细胞定位； 表达分析 川牛膝Cyathula officinalis Kuan是苋科杯苋属植物药材，为川产道地大宗药材之一，以根茎入药，味甘，性寒；具有活血化瘀、利尿通淋、通利关节等功效[12]。川牛膝主要化学成分为生物碱、甾酮类和多糖类物质，其中杯苋甾酮[34]、牛膝多糖[56]药效研究较广。现代药理研究表明，川牛膝在抗炎、抗菌、抗生育、抗肿瘤、延缓衰老等方面有活性[7]。叶绿体是植物进行光合作用的场所，叶绿体的正常发育对药用植物生长、发育及次生代谢活性物质的形成至关重要，叶绿体基因的正常表达最终影响药材外观性状和根部活性物质的积累，对川牛膝药材品质形成具有重要意义。目前，从基因水平研究川牛膝生长发育、品质形成未见相关报道 Obg（SpoOBassociated GTPbinding protein）蛋白是一类广泛存在于原核生物和真核生物的三磷酸鸟苷绑定蛋白，不仅为细菌生存所必需，在维持植物生长和叶绿体发育也是必不可少的。研究发现Obg在核糖体组装[8]、压力胁迫[9]、孢子形成[10]、细胞分化[11]等方面发挥重要作用。植物ObgC是由核编码而定位于叶绿体的鸟苷三磷酸酶，为叶绿体发育过程所需基础蛋白，促进叶绿体的正常发育形成。尽管研究表明ObgC蛋白在拟南芥[12]、水稻[13]、龙眼[14]等植物生长发育中作用关键，通过调节叶绿体RNA转录、核糖体成熟影响叶绿体发育，但ObgC在川牛膝中如何作用叶绿体形成、调节生长发育以及影响川牛膝药材品质形成等机制有待研究，为川牛膝分子生物学、药材品质研究奠定基础 本研究旨在以川牛膝各组织为材料，利用PCR，RACE等克隆技术，获取CoObgC基因cDNA全长序列，并进行生物信息学分析，分析氨基酸同源性，构建系统进化树；将CoObgC基因与载体重组形成绿色荧光融合蛋白，确定ObgC功能作用区域；同时，应用qRTPCR方法分析CoObgC基因在不同组织中表达特异性。为进一步研究ObgC蛋白家族和该基因对川牛膝生长发育与品质形成机制研究奠定基础 1材料 1.1样品 本实验所用川牛膝均于201.5年6月2.4日，采于四川省雅安市宝兴县蜂桶寨乡新康村，由四川农业大学杨瑞武教授鉴定为苋科植物川牛膝C officinalis，采集后冷藏于干冰，保存于-80 ℃冰箱备用 1.2试剂 Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa公司）；First Strand cDNA Synthesis KitReverTra Aceα（TOYOBO公司）；RACE试剂盒（ThermoFisher公司）；KODFxNeO聚合酶（TOYOBO公司）；Taq酶购自宝生物公司；SsoFastEvaGreen超混合液（BioRad公司）；EZNA Gel Extraction Kit（OMEGA公司）；所有限制性内切酶均购于北京NEB公司，各种引物均由成都擎科梓熙生物科技公司合成。其他相关生化试剂均为分析纯试剂 1.3菌株及载体亚细胞定位载体 pCAMBIA2.3003.5SeGFP保存于四川农业大学生物技术系；大肠杆菌DH5α感受态、农杆菌GV3.101感受态均购于北京博迈德生物科技公司 2方法 2.1总RNA提取及cDNA合成 将-80 ℃保存的川牛膝组织取出，在液氮中充分研磨成粉末状，按照植物总RNA提取说明书提取川牛膝RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪检测RNA提取质量。以总RNA为模板，oligo（dT）为引物，按照逆转录使用说明，反转录合成川牛膝cDNA