第2章基因工程制药9,10,11,12,13节.ppt

第九节 高密度发酵 一、概 述 高密度发酵：培养液中工程菌的菌体浓度在50g DCW/L（细胞干重/L）以上，最高200g DCW/L 外源基因表达产量与单位体积产量正相关； 单位体积产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量正相关。 高密度发酵是在单个细胞平均表达产量不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的倍增，实现总表达量的提高。 高密度发酵特点 菌体高密度，总表达量高 生物反应器体积小 单位体积生产能力高 生产周期短，分离成本小 一、影响高密度发酵的因素 1.培养基：C源、N源种类和含量；C:N含量比值；微量元素；无机盐（磷影响表达质粒的复制速率） 2.溶氧浓度：空气分离系统提高氧分压；透明颤菌血红蛋白基因克隆到菌体中，提高氧传质能力；菌体与小球藻混合培养，藻细胞光合作用产氧供菌体呼吸。 3.pH值：大肠杆菌产酸、CO2必须加碱调节pH值 4.温度：控制菌体生长，温控诱导表达（诱导时机和持续时间，对数生长期，2min） 5.代谢副产物： C源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能力，产生乙酸，抑制菌体生长和蛋白表达。采取流加补料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。 二、实现高密度发酵的方法 1.发酵条件的改进 （1）培养基的选择：6g/L的甘油作碳源（缩短工程菌的利用时间），各组分浓度较普通提高2～3倍。 （2）建立流加式培养方式：营养液（补料）分批维持菌体高生长速率时添加。补料分批发酵包括：反馈补料（恒速补料、变速补料、指数补料）；非反馈补料（恒溶氧法、pH法、菌体浓度反馈法）。 （3）提高供氧能力：加压、纯氧、H2O2、提高氧传质能力等。 2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌 （1）阻断乙酸生产的主要途径：用基因敲除技术或基因突变技术使大肠杆菌的磷酸转乙酰酶（PTA）基因pta1和乙酸激酶(ACK)基因acka失活，使丙酮酸到乙酸的合成途径被中断。 （2）对碳代谢流进行分流：丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ可将丙酮酸转成乙醇，毒性小于乙酸。 （3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流：用基因敲除技术将磷酸转移酶系统（PST）酶Ⅱ的ptsG基因破坏，降低葡萄糖的摄取速率。 （4）引入血红蛋白基因：透明颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆菌，提高氧传质能力，耐缺氧环境。 3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 rpoH基因编码大肠杆菌RNA聚合酶的r32亚基， r32亚基对多种蛋白水解酶的活力正调控。 构建rpoH基因缺陷的突变株，降低蛋白水解酶的活力。 第十节 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物都是多肽或蛋白质，其特点为： ①表达产物在初始物料中含量较低； ②含有大量细胞及代谢产物、残留培养基、无机盐； ③表达产物稳定性差，易失活、变性； ④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； ⑤应用广，对其质量纯度要求高、无菌、无热源。 一、建立分离纯化工艺的根据（各种因素） ⒈含目的产物的起始物料的特点（上游过程的各种因素对分离、纯化工艺的影响）包括： ①菌种的类型及其代谢特性、产物、副产物。②原材料和培养基的来源及其质量是否稳定。③生产工艺和条件。 ④初始物料的理化性质、生物学性质。 ⒉物料中杂质的种类和性质。 　⒊目的产物特性。 　⒋产品质量的要求 二 、分离纯化的基本过程 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 包含体 细胞碎片分离 变性 复性 三.细胞破碎 1.物理破碎法 （1）高压匀浆法 （2）高速珠磨法 （3）超声破碎法 （4）高压挤压法 2.化学破碎法 （1）渗透冲击 （2）增溶法 （3）脂溶法 3.生物破碎法：酶溶法 四.固液分离 1.离心沉淀法 2.膜过滤法 3.双水相萃取 五、重组蛋白的分离纯化技术 ①技术条件温和能保持产物生物活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。 ③收率要高。 ④两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。 目的产物的分离纯化 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。 产 物 特 性 　作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 　相对分子量 选择不同孔径的介质 　疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 　生物特异性