Immunofluorescence概要1.pptVIP

Immunofluorescence Xue Xiaoyuan 2015.07.24 1.概念 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。 利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 2.方法 ①直接免疫荧光法测抗原 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。 优点：方法简便，特异性高，非特异性荧光染色少。 缺点：敏感度偏低,且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。 应用：细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检，皮肤活 检的免疫病理检查。 ②间接免疫荧光法测抗体 3.基本原理 4.试剂 Acetone/paraformaldehyde 丙酮/多聚甲醛 Bovine serum albumin (BSA) 牛血清蛋白 Cell culture medium 细胞培养基 PBS, phosphate-buffered saline, pH 7.4 磷酸盐缓冲液 Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 Tween 20 吐温20 Antibodies against the protein of interest; Secondary antibodies 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 4，6-联脒-2-苯基吲哚 confocal microscope 共聚焦显微镜 5.步骤 1.准备细胞 2.4%多聚甲醛固定10min，4℃。 3.Washing buffer漂洗3次，每次5min。 4.(0.2%TritonX-100，2mg/ml)通透10min on ice. 5.Washing buffer漂洗3次，每次5min. 6.封闭（0.02% Triton X-100，3%BSA)RT,30min. 7.PBS漂洗5次，每次3min. 8.加入稀释的一抗，50ul/well，RT倒扣1h. 9.Washing buffer漂洗6次，每次3min. 10.孵育二抗，避光，RT30min. 11.Washing buffer漂洗6次，每次3min. 12.DAPI(1:10000),3min,in dark. 13.PBS漂洗6次，每次5min. 14.干燥2h，in dark. 15.加入抗淬灭剂10ul/well. 16.荧光显微镜观察爬片. ①细胞准备 尽量避免使用贴壁性能不好 的细胞进行免疫荧光实验，以免 后续的漂洗操作引起细胞脱落。 ②固定和通透 除细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。 a.防止细胞从玻片上脱落； 固定目的： b.除去妨碍抗原-抗体结合的类脂； c.使标本易于保存。 a.不能损伤细胞内的抗原 固定原则： b.不能凝集蛋白质 c.应保持细胞核亚细胞结构 d.固定后应保持通透性 常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。 常用的固定剂：有机溶剂和交联剂。 ①有机溶剂（甲醇，丙酮等）可除去类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。 ②交联剂（如4%多聚甲醛）通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。 交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构。 通透 最常用的通透剂0.2%Triton-X100+2mg/mlBSA，4℃10min。 对于水不溶性地目的抗原的检测宜先通透再固定，主要是可以去除许多水溶性的蛋白，可大大减少免疫荧光的背景和非特异性信号。 ③封闭 0.02% Triton-X100，3%BSA 目的：减少抗体的非特异性结合。 ④抗体孵育 二抗注意避光，保证质量和防止干燥，抗体孵育尽量在湿盒中。（用之前一定离心，否则沉淀在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点） ⑤封片及荧光观察 甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，需要加入抗荧光淬灭剂。 ⑥标本保存 低温（4℃或-20℃）下保存，一定要避光。 6.设置对照 设立对照的目的：证明肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问，有助于判断实验中出现的问