双水相体系的形成与分配机理.ppt

; 掌握： 了解： 重点： 难点：;; 技术诞生 1896年Bei jerinck观察到 先得到一浑浊不透明溶液，随后分为两相, 水相也可以分为两相，即双水相系统 ? 将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一个水相中__双水相萃取. 开始于本世纪70年代，现已应用到酶、核酸、生长激素、病毒等分离提纯。近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。;(2)双水相体系; 向水相中加入高分子化合物PEG/葡聚糖或盐，在一定组成范围内，可以形成密度不同的两相。 轻相富含高分子化合物PEG， 重相富含盐或高分子化合物Dx葡聚糖。 ;葡聚糖-甲基纤维素钠两相体系;;各 种 双 水 相 体 系;(3)双水相体系的类型 ;;4. 聚合物双水相形成机理;(5)双水相萃取分离的原理;双水相体系的相图;K 临界点;M点, 两相T和B的量之间的关系(体积)服从杠杆规则，即;2.3.2.1 双水相分配系数 分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用。 包括：静电作用 疏水作用 生物亲和作用。 分配系数是各种相互作用力的和。 lnm=lnme+lnmh+lnml;2.3.2.2 影响分配系数的因素分析 1）成相聚合物?---相对分子质量和浓度影响分配平衡. 对于成相聚合物系统和生物大分子来说： ;2）盐的种类和浓度 ---主要影响相间电位和蛋白质疏水性。;影响蛋白质的表面疏水性， 改变各相成相物质组成和相体积比. 分配系数随盐浓度增加而增加,不同蛋白质增加不同.;3）pH值 ;;温度的影响;6)双水相体系物理化学性质的影响：;系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此,分配系数应该是1。;2.3.3.1 双水相系统的选择 选择原则： 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的差别 综合利用静电作用、疏水作用,添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。;目标产物与杂蛋白的等电点不同， 调节系统pH值，添加适当盐，产生希望的相间电位。 目标产物与杂蛋白的疏水性不同??充分利用盐析作用 增大成相系统浓度－使细胞碎片选择性分配于下相。 采用相对分子质量较大的PEG 降低蛋白质的分配系数，提高目标蛋白的选择性。 ;2.3.3.2 双水相萃取过程 包括： 双水相的形成 溶质在双水相中的分配 双水相的分离。;萃取一般操作;图5-19 聚已二醇(PEG)-磷酸盐双水相体系萃取酶的一般流程;两步萃取法连续分离胞内酶的流程图;2.3.3.3 双水相萃取的特点： 相混合能耗低， 达到萃取平衡所需的时间短 易进行工业放大(10ml离心管的实验结果即可放大） 适于易失活的蛋白质的提取纯化（超滤或沉淀） 易实现连续操作－最大特点;可用于多种生物活性物质的分离纯化 1）酶的提取和纯化 酶主要分配在上相，菌体在下相或界面处. ;表5-7双水相萃取体系从微生物的破碎细胞中提取分离酶的实例;2）核酸分离纯化 用PEG/Dextran体系萃取核酸时，盐组分的微小变化将会引起分配系数的微小变化。 3）人生长激素的提取 用PEG4000 6.6%/磷酸盐14％体系从E.coli 碎片中提取人生长激素（hGH) （hGH)分配在上相，分配系数6.4，收率60％.;从E.coli中提取hGH的三级错流萃取;4）β干扰素（ β-IFN)的提取 不用PEG/Dextran体系 用PEG－磷酸酯/盐的体系才能使β-IFN分配在上相，杂蛋白分配在下相。;5）病毒的分离纯化 6）生物活性物质的分析检测 7)在中草药有效成分分离中的应用p85; 双水相体系形成、类型及机理