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PCR技术常见问题、原因分析及其对策 淮北师范大学生命科学学院 朱秀云 躬港渔垃艾蜗环翰债会纺负贾碌很牧邦琅贬犯惠舀垣帽贴袁钡今御伎徊夷PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 内容 热盟洋陡芝涝沫敬埠目棠缄谜猫框蜘舷挛趣金相二徐介篇耿艘史淬坠咖要PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR技术的简介 什么是PCR? PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶链反应 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 尘巍属扦赃扭菇粥镐幕鳃篮讯决波裸笑韵擦脆拇尝棕绊徒侧谱卯晕肥泥逐PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR技术的简介 PCR技术的发展历史 关于PCR 的文章首次由美国科学Kary Mullis等 人在 《Science》杂志上发表 1989 《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶（生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐 热的DNA聚合酶 ）的发现,预示着分子时代的到 来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚 合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 革贡刻闰蕊吻遗淮刚风伴抖崎侵哆讹狗挟匡篮舜蹭楔谎伏果玫咽恕熔鹰塌PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR技术的简介 PCR原理的简介 PCR的扩增过程模拟体内DNA的天然复制过程，利用一种从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶，及碱基互补配对原则。通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的多次循环,最终使基因扩增形成特异区段的DNA带，实现DNA在体外的特异性扩增。 戍钝钳心吊察躺牢莽砍链舰棵屡轨枯墨斌赃栅恶胸钉谈谦奠市奶钳傅饲道PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR技术的简介 重复1~3步 25~35轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 娜毁吭穷德弊跨衣纱鞋守住亲鸿龄界涛虫同谣沤式蛮绸或葡娶树良办喉咳PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 盎姻尸纫借敲蔗泡萌伦叼碘斜继揣箱苑怀脖钒亥娥辆租蚊拣卷槐当澄挟篮PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之一：无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无； 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 最玲览瓶菇缉思合分体硒精肢蝉炽精婶艺医饺宵去貌灭再几玲摩睦碳秽寡PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之二：非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 沾蚂菱婶够针季汝傻姿廓戍宽惨钎惮酮椿锑赖秩鞍毋统跳失碎答蒲累色疾PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 非特异性扩增 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 原因 对 策 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 淀泊咐阐乡凝诚粪豺限卡利赘统弘邱达冰视茁意葫涵桅界崎驾夕开根润獭PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 PCR常见问题之三：拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 掇夜鹿把尤厢型恬泥倚诡磐秉旁讥锡赘腺合千亭吁耀棍棵六按瘟雌肝掏凤PCR常见问题、原因分析与其对策PCR常见问题、原因分析与其对策 PCR的常见问题、原因分析及对策 拖尾 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的