试验报告[2010-12-12]第1页，共2页编号农业微生物研究中心[2011-11.docVIP

编号：生物[2011-11-30] 共23页 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：Perl脚本开发：trimPE初版， 整合的质量修剪工具 试验人员：唐唯其 试验负责： 报告日期：2011-11-30 计数月份：2011年11月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591 试验目的 本文开发的trimPE是对高通量Paired-End测序进行质量修剪（Quality Trimming）的工具。 1.1 前言（背景） 测序过程中，每个碱基发生测序错误的概率，比如0.001，即千分之一，表示每1000个碱基中只有1个碱基可能发生测序错误。概率值可以通过公式转换成log值，换算成整数，即测序的质量值，一般称之为phred值。phred是一款在sanger测序中，常用的重叠群Contig拼接软件，因phred的普遍应用，称log质量值为phred值。 而在fastq文件中，为了表示方便，用ASCII码来表示phred值，如20、30这样占两个字符的phred值就可以用只占一个字符的ASCII码来表示，以便和碱基一一对应！这是一种聪明的做法，不是吗？与FASTQ同时的，还有其他一些同时包含序列和测序质量的文件格式（见附录），但都没有FASTQ简明。后来，在FASTQ格式的发展过程中，形成了三种标准，Sanger fastq，solexa fastq和illumina 1.3+ fastq（细节见附录），因此，在后期处理测序质量的生物信息学工具中，往往会要求用户指明哪种fastq规范（原始测序结果通常是illumina 1.3+，而sanger fastq则为更多的软件所识别），或者，有些软件也可以自动识别fastq规范。 1.2 质控的主要内容 我们归纳了新一代测序技术中读段质控的主要内容，包括： 质控统计：读段数量、碱基总数、GC含量…… 格式转换：从测序原始数据转换为fastq格式，三种fastq打分标准之间进行转换。 去除不相关序列：包括污染序列、载体Vector、接头序列甚至rRNA、tRNA等； 质量修剪：去除低质量的末端； 质量校正：校正测序错误的碱基； 读段过滤：包括自动过滤，长度过滤，即舍弃整条不需要的读段。 质控可视化： 1.3 质量修剪和质量校正 本文的研究内容是质量修剪！ 为了减少测序之后拼接以及比对中的错误，质量修剪（Trim）和质量校正（Correct）是两个不同努力方向。前者舍弃（remove）低质量的碱基及读段，后者并不舍弃低质量碱基，而进行校正！ 但两者是可以结合的，一般可以先修剪再校正！因为即使经过质量修剪，除去低质量的碱基之后，在基因组规模大、测序深度高的情况下，依然有为数不少的测序错误，可以进一步校正。退一步讲，未经质量修剪的读段3 末端容纳了大量测序错误，这些碱基难以被校正！ 一般可以通过Kmer频率来进行质量校正，Kmer是预设的序列长度值，需要在内存中建立4的kmer次方的后缀数组（suffix array），因此需要用到非常大的内存！质量校正的工具有：Quake、Corrector（BGI）、 而质量修剪所消耗的计算机资源较少，一般而言，在读段拼接之前，质量修剪是一项很有必要的步骤（其效果见下一节），而质量校正是可选的步骤，条件允许，建议进行质量校正。 1.4 要不要做质量修剪？质量修剪的必要性 从图1（Murray et. al, 2010）可以看到经过质量修剪之后，拼接效果要比没有质量修剪的结果更好！本实验室在青枯雷尔氏菌的拼接过程中，也同样比较了未修剪（裸拼）和有修剪的差别，证实质量修剪有助于提高拼接效果！ 图1 经过质量修剪后的de novo拼接要比裸拼（读段未修剪）的效果要好 图片来自于BMC Bioinformatics 2010 SolexaQA的文章 1.5 综述：质量修剪算法和工具 1.5.1 modified Mott trimming algorithm 本文所采用的质量修剪算法是modified Mott trimming algorithm，该算法被应用在PHRED、CLC Genomics workbench这两款商业软件中。前者是Sanger测序时代拼接三件套之一，是主流拼接软件，质量修剪在Sanger时代，也是一个拼接前的重要步骤；而后者是一套生物信息学工具集，有很多是N