菌种的复苏传代及保存标准程序.docVIP

菌种的复苏传代及保存标准程序 目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。 范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。 职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。 内容： 菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。 1.菌种的复苏 1.1冻干菌种的复苏 检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。 1.1.1准备： ①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。 ②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。 ③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。 1.1.2操作： 1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。 1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。 1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。 1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。 1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将 冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。 1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置23～28培养5～7日4℃左右的冰箱中保藏。每隔 1个月移种一次，继续进行保藏。 3.2.2适用范围：细菌、酵母菌、真菌保藏。 3.2.3各类菌种保藏条件及时间： 菌种 培养基 保存温度 传种时间 细菌 一般多用营养琼脂或根据菌种规定选用培养基 4~6℃ 芽孢杆菌3~6个月 其它细菌每个月 酵母菌 一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂 4~6℃ 一般4~6个月 丝状真菌 一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等。 4~6℃ 每4个月移植一次 （每2个月移植一次） 3.2.4注意事项： ①保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。 ②保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。 ③必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。 ④每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。 ⑤铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，应在室温下保存。 3.3液体石蜡保存法：利用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。3.3.1方法： 3.3.1.1将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~ 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。 3.3.1.2取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中 1 ~ 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。 3.3.1.3将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 ㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。 3.3.2适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。 3.3.3注意事项： ①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。 ②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。 ③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。 ④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精 灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。 ⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1 ㎝为宜。⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。 4.菌种在传代、保存或使用过程中发现污染、变异，应及时销毁，不得用于常规检验。 5.菌种传代、保存及使用、销毁均应填写相应记录：《0代菌种保管使用记录》、《冻存菌种保管使用记录》、《菌种传代记录》、《菌种使用记录》及《菌种销毁记录》。 6.菌种按“检定菌管理制度”管理。 7.附录： 7.1菌种编号：传代复苏的菌种应有统一