电针与电针合并氟西汀治疗抑郁症的基因谱表达异同的研究论文.docVIP

　　电针与电针合并氟西汀治疗抑郁症的基因谱表达异同的研究论文 .freelbleGen全基因组表达谱芯片测试并进行数据分析。结果电针组“纠偏”的基因有226条;针药组“纠偏”的基因有221条，“增偏”的基因(与正常组的差异更甚于模型组)有9条。两组“纠偏”的基因均以下调的基因为主，涉及凝血、炎症和凋亡相关基因等，其中电针组为125条，针药组为157条;而上调的基因包括蛋白质生物合成有关的基因、嗅觉感受器和微管系统基因等，其中电针组为101条.freel生物芯片杂交仪(美国BioMicro Systems);Genepix4000B Scanner芯片扫描仪(美国Axon公司)。Trizol (美国invitrogen公司)，RNeasy kit(RNA提取试剂盒) (德国Qiagen公司);Cy3(吲哚类菁染料)等。 2 方法 2.1 分组大鼠经适应性饲养1周后用OpenField法作行为学测试。实验中所用“敞箱”以morris迷宫代之。用该系统记录大鼠在3 min内的水平活动轨迹并计算相应的路程，以反映大鼠的活跃程度或抑郁状态，比通常所用敞箱数方格的方法准确。为了尽可能降低实验数据的离散度，经反复实验，选取水平路程在(2 700～3 500 cm)的正常大鼠进行实验。另以大鼠两只前肢离地直立次数为垂直活动得分，以反映其对外界的好奇心和探究心理。由于直立次数在个体间的差异较小，一般按水平路程的测试结果进行评价。将水平路程相近的40只大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、针药组，共4组，每组10只;正常组每笼饲养5只，其余各组每笼1只(置小笼中孤养)。 2.2 造模模型组、电针组、针药组大鼠，共接受21 d各种不同的应激，包括冰水游泳(4℃，5min)、热应激(45℃水浴，5 min)、禁水(24 h)、夹尾(1 min)、电击足底(电压50 mV，每隔15 s刺激1次每次持续10 s，共15次)、摇晃(1次/s，5 min)、禁食(24 h)和昼夜颠倒等刺激，每天随机给予1～2个刺激，相同的刺激不连续出现，每种刺激总共不少于4次。正常组大鼠不接受应激，并饲养在另一间房间以免受影响。 2.3 治疗(造模结束行为学测试后立即介入治疗)正常组：继续常规饲养，每笼饲养5只;模型组：继续孤养，不予任何治疗措施;电针组：继续孤养，电针治疗。治疗时操作者采取坐姿，弯膝，两腿间铺以隔水的塑胶，取一废枕头套置其上，大鼠自笼中取出后令其趁势钻进枕头套中，遮蔽其双眼并用手固定其头部。选择百会、印堂穴：根据《实验针灸学》5大鼠穴位图谱选百会穴，并依据比较解剖学，在大鼠前正中线与额顶骨缝交界线前方处定印堂穴。选用苏州医疗用品厂生产的“华佗”牌0.35×13 mm针刺针进行治疗。针刺方法：百会穴、印堂穴均向前(鼻侧)平刺4 mm，分别接韩氏穴位神经刺激仪的正负极，频率2Hz，输出电流1 mA，刺激时程15 min/次，1次/d。在施针过程中保持安静，避免惊吓大鼠，减少额外刺激。针药组：按照1.8 mg·kg1给予氟西汀灌胃后30 min施以电针。由于大鼠的生活规律为昼伏夜出，为了不干扰其白天休息，特意在20：00～24：00进行治疗。分别于造模前(d0)、造模结束(d21)及治疗一周后(d28)测定各组大鼠的体质量、行为学(水平运动和垂直运动)和糖水消耗量。 2.4 取材治疗1周后处死各组大鼠，开颅取脑，在冰盒上分离海马，置液氮中保存。正常组、模型组、电针组、针药组大鼠各取1个标本送交上海康成生物工程有限公司进行RocheNimbleGen全基因组表达谱芯片测试以及real timePCR验证，芯片名称为Rattus norvegicus 12×135Karray。 2.5 全基因组表达谱芯片主要实验流程 2.5.1 总RNA的抽提及质量检测取正常组、模型组、电针组、针药组大鼠海马组织各100 mg，用Trizol和RNeasy kit抽提RNA，使用Nanodrop测定RNA在260 nm、280 nm和230 nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。 2.5.2 cDNA样品合成和标记取1μg总RNA，反转录成cDNA并用Cy3标记。 2.5.3 标记效率质量检测使用Nanodrop检测荧光标记效率，保证后续实验的可靠性。 2.5.4 芯片杂交在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片在杂交盒中65℃滚动杂交17 h，依次用相应的洗涤液洗涤芯片，室温晾干。 2.5.5 图象扫描及数据处理用Genepix4000B Scanner扫描芯片，以NimbleScan softalized )，将标准化后的数据导入Genespring GX (Agilent versio