珍稀药用金钗石斛组培苗遗传稳定性直接扩增长度多态性检测论文.docVIP

　　珍稀药用金钗石斛组培苗遗传稳定性直接扩增长度多态性检测论文 【摘要】 目的研究珍稀药用金钗石斛DNA指纹图谱，初步探讨直接扩增长度多态性(DALP)分子标记技术在石斛组织培养过程中遗传稳定性检测上的应用。方法采用直接扩增长度多态性(DALP)技术对金钗石斛野生移栽苗和组培苗进行基因组DNA多态性分析。结果从12对引物组合中筛选出6对能获清晰条带的引物组合，分别利用琼脂糖和聚丙烯酰胺对DALP-PCR产物进行凝胶电泳，发现两组苗扩增的DNA带型基本一致，未发现明显变异，说明金钗石斛茎尖离体继代培养具有较高的遗传稳定性。结论DALP分子标记技术可用于石斛遗传稳定性和遗传多样性研究。 【关键词】 金钗石斛; 组培苗; 直接扩增长度多态性; 遗传稳定性; 指纹图谱 Abstract：ObjectiveTo study DNA fingerprint of Dendrobium nobile and application of direct amplification of length polymorphism (DALP) to the identification of geic stability on the course of tissue culture. MethodsThe polymorphism of transplanting D. nobile er binations screened from 12 pairs of primer binations might amplify clear bands. By agarose and polyacrylamide gel electrophoresising, respectively, the DNA bandtypes of DALP-PCR products olecular marker technology can be used for the research of the geic stability and geic diversity on Dendrobium. Key nobile; Tissue culture seedling; DALP; Geic stability; Fingerprinting 金钗石斛Dendrobium nobile Lindi.为兰科石斛属多年生附生草本植物，《本草纲目》认为其能“强阴益精，厚肠胃.freelplification of Length Polymorphism，DALP)技术对金钗石斛野生移栽苗和组培苗进行基因组DNA指纹图谱分析，初步探讨DALP分子标记技术在石斛组织培养过程中遗传稳定性检测上的应用，为人工繁殖促其产业化生产提供技术支撑。 1 材料 试材为从云南潞西2004-10采集的金钗石斛(Dendrobium nobile Lindle)野生株系，栽种在重庆市中药研究院药植园内，同年取其茎尖进行愈伤诱导培养，得其无菌苗的多年继代组培苗。分别以引种的野生栽培苗和继代组培苗的新鲜叶片为实验材料。 2 方法 2.1 组织培养取消毒后的金钗石斛野生苗茎尖作为外植体依次分别接种在培养基①MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0%蔗糖，②MS+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA+ 0.05 mg/LNAA+2.0%蔗糖和③1/2 MS + 0.1～0.5 mg/L IBA + 0.5～2.0 mg/L NAA(含椰汁和香蕉提取物)上进行诱导、增殖和生根培养。 2.2 DALP检测 2.2.1 DNA提取采用改良的CTAB法提取基因组DNA5，每种取0.3～0.5 g新鲜叶片。 2.2.2 DALP扩增从每种样品中各取1份DNA样品进行预备实验，选出6组能获得清晰条带、反应稳定的随机引物组合：P1P3、P1P4、P2P3、P2P4、P1P5和P2P5，引物名称和序列见表1。表1 本研究中DALP引物组序号与序列 反应体系：采用20 μl反应体系，其中模板DNA70～80 ng，2.5 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10×Buffer，2 μl 2.5 mmol/L dNTPs(总的dNTP为10 mmol/L)，0.5 μl 5U/μl Taq酶，3 μl 5 μmol/L选择性引物，1μl 5 μmol/L反向引物(北京鼎国合成)。对照中的DNA模板用去离子水代替，其余成分皆同。 扩增仪为Eppendorf梯度扩增仪，扩增程序为：95 ℃预变性5 min，然后先进行12个循环：94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，该循环复性温度为0.5 ℃梯度降温;然后再进行18