牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（二）论文.docVIP

　　牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（二）论文 5）金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性 在基因工程技术中，表达的重组蛋白多以包涵体形式存在，蛋白质经常会错误折叠而丧失活性，这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体，然后控制变性剂除去的速度，有时需要添加适当的氧化/还原试剂，蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种，分别是稀释复性、透析复性和层析复性。 （1）稀释复性：直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种方法操作简单.freelA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，本研究在此基础上，拟将此质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达，然后用固定化金属螯合亲和层析技术得到纯化的FimA蛋白，为下一步获取免疫血清、进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的免疫疫苗提供实验基础。 3 实验一 fimA在大肠杆菌中的表达 3.1 实验材料与仪器 3.1.1 菌珠 1）大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：北京天根生化科技有限公司。该菌株基因型为：F-，ompT，hsdSB(rB-mB-)，dcm(DE3)，gal，pLysS，Cam r，该菌珠所带pLysS具有氯霉素抗性。此质粒含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 2）携带有pET-15b Vector和pET-15b-fimA的大肠杆菌TOP10（本课题组前期实验获得）。其中pET-15b Vector：原核表达载体，双链环状DNA，由5708 bp组成，含有可插入外源基因的多克隆位点（MCS）、Amp抗性基因、T7 lac、T7 promoter、lac operator、T7 terminator、N-末端His-Tag（6个组氨酸）。是一种组氨酸融合表达载体，这6个组氨酸标签便于用钴柱纯化或以抗组氨酸抗体筛选。pET-15b载体读框及多克隆位点见图3.1，其克隆、表达区见图3.2。 图3.1 原核表达载体质粒pET-15b图谱 图3.2 pET-15b载体克隆、表达区 3.1.2 主要试剂 1）DNA Marker VI：北京天为时代科技有限公司 2）预染蛋白质MarkerⅢ：北京天根生化科技有限公司 3）细菌LB培养基（胰蛋白胨、酵母提取物）：Promega公司 4）琼脂糖（Agarose）：上海生工生物技术有限公司 5）琼脂粉（Agar poresco USA 8）考马斯亮蓝（Brilliant Blue R-250）：上海绿岛科技发展有限公司分装 9）ECL底物化学发光试剂盒：Pierce Biotechnology USA 10）质粒小提试剂盒：北京天为时代科技有限公司 11）硝酸纤维素膜（NC膜）：浙江省台州市四甲生化厂 12）一抗（Anti-his antibody，小鼠单克隆抗体IgG2b）：北京天根生化科技有限公司 13）二抗（Goat anti-Mouse IgG，(H+L)，Perpxidase Conjugated）：Pierce Biotechnology USA 14）脱脂奶粉：完达山乳业股份有限公司 15）其他生化试剂如溴化乙锭（EB）、冰醋酸、甲醇、过硫酸铵、无水乙醇、NaCl、CaCl2、MgCl2、氨苄青霉素、氯霉素等，均为进口或国产试剂 3.1.3 实验仪器 1）自动双重纯水蒸馏器SZ-93：上海亚荣生化仪器厂 2）超纯水设备Elix3+Mil-GB：法国Millipore公司 3）电子分析天平AA-250：Denver Instrument pany 4）恒温磁力搅拌器78HA 8）塑料薄膜封口机SG-200型：上海凯明电子机械有限公司 9）紫外线消毒灯ZSZ：北京海淀空后高温复合材料厂 10）生物型洁净工作台BCM-1000A：苏净集团安泰公司 11）微量移液器Research单道/多道：Eppendorf 12）恒温培养箱HH.B11.420-BS：上海安亭 13）大型摇床QYC-211：上海福马实验设备有限公司 14）空气浴震荡器HZQ-C：哈尔滨市东明医疗器械厂 15）离心机（台式低速）TDL-40B：上海安亭科学仪器厂 16）离心机Sigma1-15（台式高速）和Sigma3K18（台式高速冷冻）：Sigma 17）离心机（超微型）E-Centrifuge：aker 5900：中晶科技 29）冷冻干燥系统Lyph-Lock 12 Liter：Laboconco公司 30）普通冰箱NR-B22S1：无锡松下冷机有限公司 31）低温冰箱925型：Forma Scientific 3