灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α, IL2 mRNA表达的拮抗作用论文.docVIP

　　灵芝多糖对前列腺素E2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α, IL2 mRNA表达的拮抗作用论文 张群 雷林生 余传林 吴曙光 【摘要】 【目的】观察灵芝多糖（GLB）对前列腺素E2（PGE2）抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α、IL2 mRNA表达的拮抗作用。【方法】采用混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖程度，半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测IL1α及IL2 mRNA的表达水平。【 结果】PGE2连续作用48h后，脾细胞增殖反应受到不同程度的抑制作用，当PGE2浓度在10 μmol/L以上时差异有显著性意义(P＜0.01);固定PGE2的浓度为20 μmol/L，并合用不同浓度的GLB（25、50、100、200mg/L），当GLB为100 mg/L以上浓度时可部分对抗PGE2（20 μmol/L）的抑制作用(P＜0.05);培养8h及12h后，PGE2（20 μmol/L）可抑制IL1α及IL2 mRNA的表达.freelg/L以上浓度时可部分对抗PGE2的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】灵芝多糖可部分拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞增殖及IL1α和IL2 mRNA表达的抑制作用。 【关键词】 灵芝多糖/药理学； 肿瘤/中药疗法； 肿瘤/免疫学； 细胞培养 灵芝［Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr. Karst.)］是灵芝菌科灵芝属真菌。文献报道［1-3］，灵芝多糖（GLB）是灵芝中主要的生物活性成分之一，其主要的药理作用为增强免疫功能和抗肿瘤。目前其抗肿瘤作用的机制尚不清楚。肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂，其中之一是有些肿瘤细胞能直接分泌［4-5］或刺激巨噬细胞［6］分泌前列腺素E2(PGE2)，后者可对免疫系统产生广泛的抑制作用。藉此，肿瘤得以逃避免疫系统的攻击，在体内无限生长。本研究观察了灵芝多糖对PGE2抑制小鼠脾细胞增殖及IL1α和IL2 mRNA表达的影响，探讨灵芝多糖的抗肿瘤免疫学机理。现报道如下。 1 材料与方法 1.1 动物 C57BL/6j及BALB/c小鼠（SPF级），8～10周龄，雌雄兼用，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号分别为：2005A044和2005A046。 1.2 药品与试剂 RPMI1640培养基（GIBCO公司产品）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；HEPES（MDBio, Inc分装）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、焦碳酸二乙酯（DEPC）、前列腺素E2（PGE2）均为Sigma产品；RNAoutTM（深圳市华氏生物技术有限公司产品）；傻瓜逆转录（RT）反应体系［AccuPoa Scientific 公司）；AB120型电子分析天平（美国Denver Instrument公司）；连续波长酶标仪（BioRAD公司）；CS15R台式低温高速离心机（Bechman公司）；PTC100TMPCR循环仪（美国MJ Research. Inc.公司）；Po处的光密度(D570)值表示。 1.4.3 总RNA提取 根据试剂盒说明书所提供的方案按比例缩小进行操作。于96孔板中，每孔加RNAoutTM试剂40μＬ，每组收集10孔裂解液于0.5mＬEppendorf管中，提取总RNA。 1.4.4 逆转录反应 DEPC处理水配制的Oligo dT18 (10 nmol/L)与DEPC处理水配制的总ＲＮＡ （0.1 mg/L）按体积比1∶1混合于Eppendorf管中，70℃孵育5min，４℃冷却２min。吸取上述混合液20μL加入AccuPoin离心3s，置PCR循环仪中反应。反应参数如下：42℃、60min，94℃、5min。 1.4.5 PCR扩增 PCR引物采用在线软件Primer 3进行设计。小鼠IL1α：上游引物 5’GCATCCTCACAGCAGGATTT3’，下游引物 5’GAATCCAGGGGAAACACTGA3’，PCR扩增产物为354bp。小鼠IL2：上游引物5’AAGCTCTACAGCGGAAGCAC3’，下游引物5’TCATCGAATTGGCACTCAAA3’，PCR扩增产物为348bp。小鼠βactin：上游引物 5’CCAGAGCAAGAGAGGTATCC3’，下游引物 5’GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA3’，PCR扩增产物为216bp。经预实验发现IL1α和IL2 mRNA的表达丰度约为βactin的1/5左右，为了使被检测基因的扩增速率与βactin的扩增速率基本一致，均处于指数扩增范围从而防止平台效应，在进行βactin基因扩增时，将逆转录第1链cDNA 产物稀释5倍，其