溃克灵对溃疡性结肠炎模型大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群的影响论文.docVIP

　　溃克灵对溃疡性结肠炎模型大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群的影响论文 周红光，陈海彬，徐肇敏，于成功 【摘要】 目的建立溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型，研究溃克灵(KKL)对大鼠UC的治疗作用及对大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ 调节性T细胞的影响，探讨KKL防治UC的作用机理。方法采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)法(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)灌肠复制出UC大鼠模型。将72只大鼠随机分为正常组.freela公司生产，批号为(2008-16-2)。鼠IL-8酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自美国Pierce公司。KQ-250E电动玻璃匀浆机;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机;55P-7高速冷冻离心机;MDF-U281超低温冰箱等。 2 方法 2.1 造模方法成年l/100 g)后，将造模组大鼠固定，将直径2.0 mm长12 cm的输液管经液体石蜡润滑后,由大鼠肛门轻缓插入深约8.0 cm处, 一次性将TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)用橡胶输液管轻缓注入距大鼠肛门约7~8 cm深的肠腔内留置，将大鼠头向下倾斜45°，放置1 min，然后保持平躺状态自然清醒。对照组12只大鼠予上述方法等量生理盐水灌肠。 2.2 药物制备及剂量计算溃克灵成人用药39 g/d，以成人体质量60 kg估算，剂量为0.65 g/kg。参考相关文献，根据人与动物等效剂量换算方法(通过体表面积换算)，大鼠小、中、大剂量按照成人用量的5，10，20倍计算，即3.25，6.5，13 g/kg。1.28 g/ml溃克灵药物用蒸馏水配成325，650，1 300 g/L，大鼠灌胃给药体积为10 ml/kg。SASP：成人用量每天3 g，以成人体质量60 kg估算，成人用量约0.05 g/kg，大鼠取10倍成人用量即0.5 g/kg，药物用蒸馏水配成50 g/L，大鼠灌胃给药体积为10 ml/kg。 2.3 分组与给药造模后第3天，将造模组大鼠按性别、体质量分层随机法分为5组：模型组，溃克灵小、中、大剂量组，SASP组，每组12只;对照组大鼠12只，为正常组。雌雄分笼饲养。同时开始按照上述剂量给药，模型组及正常组给等体积蒸馏水，每天1次灌肠，连续给药21 d。 2.4 标本采集与处理大鼠禁食24 h(不禁水)后，眼眶取血3 ml,经3 500 r/min,15 min低温离心,分离血清500 μl，置-80℃冰箱贮藏，以备检测。采血后断头处死，迅速剖腹，取出距肛门8 cm以上处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷生理盐水冲洗肠内容物，滤纸吸干，修取病变最明显处结肠组织进行肉眼观察，将标本用10%福尔马林固定，24 h后进行漂洗，逐级酒精脱水,二甲苯透明,石蜡定向包埋;5 pm厚切片,HE染色,中性树脂胶封片,光镜下观察。 2.5 外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群检测(流式细胞仪)取肝素抗凝的外周血和制备的肠系膜淋巴结细胞悬液各100 μl，置于流式专用管中，分别加入上述荧光素标记的抗体，其中FITC-CD4，Percp-CD3各4 μl，PE-CD25 1.5 μl，室温避光孵育30 min后，外周血中加入红细胞裂解液(1∶9稀释)2 ml/管，室温放置15 min。所有样本均于1 500 r/min 离心20 min，弃上清液，用冷PBS液3 ml洗2次，最后用0.5 ml PBS重悬，上机(Becton Dickinson)检测。 2.6 统计学方法所有数据均输入计算机，采用SPSS13.0统计软件处理，实验数据以±s表示，根据方差齐性采用单因素方差分析和q检验。 3 结果 3.1 各组主要症状及体征变化比较 造模后第2天，模型组大鼠出现腹泻，为黄色稀便、半稀便甚至血便。此时大鼠毛色失去光泽，活动及进食明显减少，体质量下降，喜贴边及扎堆，反应迟缓、懒动。用药后7 d KKL大剂量组大鼠精神渐恢复正常，毛色渐有光泽，食欲增加，活动逐渐增多，大便在第2周转为稀便后逐渐正常。用药后第8天 KKL中、小剂量组及SASP组大鼠的精神开始恢复正常，毛色渐有光泽，食欲增加，活动也逐渐增多。正常组大鼠则无上述精神、食欲、活动、毛色异常以及大便变化。 3.2 各组大鼠大体形态及组织病理改变比较 正常组大鼠结肠黏膜上皮完整，黏膜下血管正常，无充血水肿，腺体排列整齐;模型组大鼠结肠黏膜不同程度充血、水肿、糜烂，溃疡形成，病变以结肠下段最明显;镜下黏膜及黏膜下层血管高度扩张充血，大量炎细胞浸润，腺体破坏，结构紊乱;溃克灵各剂量组及SASP组可显著改善结肠黏膜的充血、水肿、糜烂，黏膜及黏膜浅层仅有少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润。其中溃克