层析分离技术导论.ppt

1．分配系数分配常数Kd 在凝胶层析中，引入一个分配常数Kd ，它表示某溶质分子可以进入凝胶颗粒内部空隙的分数。 凝胶色谱柱的总体积Vt分为三部分： Vt=V0+Vi+Vm V0——凝胶颗粒之间空隙的总体积（即外水体积） ； Vi——凝胶颗粒内部空隙的总体积（即内水体积） ； Vm——凝胶颗粒基质本身所占体积。 某溶质分子充满层析柱的体积（即洗脱容积Ve）为： Ve=V0+ Kd Vi → Kd=(Ve-V0)/Vi Ve——被测分子的保留体积（见层析曲线） V0——可采用一个分子量远超过凝胶排阻极限的有色分子来测定，此时的保留体积V1即为层析柱的V0 = V1； Vi——可以选用一个可自由扩散的小分子（如中性盐）溶液来测定，此时的保留体积V2= V0 + Vi 1．分配系数分配常数Kd 0≤Kd≤1 当Kd=0时，意味着溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外，而最先被洗脱； 当Kd=1时，意味着溶质分子完全不被排阻，可以自由进入所有凝胶颗粒的微孔中，而最后被洗脱。 在实际操作时，有时会出现Kd1的情况，表明除了凝胶的分子筛作用外，还存在着吸附作用。 2．层析曲线 在柱层析中，常用层析曲线（又称色谱流出曲线即色谱图）来表示层析效果。 图9-3 层析曲线示意图 2．层析曲线 （1）基线 （2）保留值 （3）相对保留值 （4）区域宽度 2．层析曲线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线，在条件稳定时为一直线（如图9-3中的ot）。 （1）基线 2．层析曲线 表示试样中各组分在层析柱内停留的时间数值。通常用时间或相应的流动相体积来表示。 1）时间表示的保留值 2）用体积表示的保留值 （2）保留值 2．层析曲线 ①保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间（如图9-3中的O’B）； ②死时间（tM）：不与固定相作用的流动相的保留时间（如图9-3中O’A’所示）。 ③调整保留时间（ tR ′）：指扣除了死时间的保留时间（如图9-3中的AB）， tR ′= tR - tM 注意：当固定相一定，在确定的实验条件下，任何物质都有一定的保留时间，它是色谱分析法的基本参数。 （2）保留值——1）时间表示的保留值 2．层析曲线 ①保留体积（VR）：指从进样到柱后出现待测组分浓度极大值时所通过的流动相体积。 VR = F0×tR（ F0为层析柱出口处的流动相流量，即体积流动率，单位：ml/min。） ②死体积（VM）：指层析柱内除了填充物固定相以外的空隙体积、色谱仪中管路和连接头间的空间及检测器空间的总和。 VM =F0×tM ③调整保留体积（VR′）：指扣除了死体积后的保留体积。 VR′ = VR － VM 。 （2）保留值——2）用体积表示的保留值 2．层析曲线 指组分2和组分1调整保留值之比，是一个无因次量，即： r21 = tR2 ′ / tR1 ′ = VR2′ / VR1′ 注意：相对保留值只与柱温及固定相性质有关，与其他层析操作条件无关，它表示了层析柱对这两种组分的选择性。 （3）相对保留值r21 2．层析曲线 用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： 1）标准偏差σ：当层析曲线（色谱峰）呈高斯分布时，曲线两侧拐点之间距离的一半，即峰高0.607倍处峰宽的一半（如图9-3所示）。 2）半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度。如图9-3中的GH。 注意：由于半峰宽容易测量，使用方便，所以一般用它来表示区域宽度。 3）峰基宽度Wb：即通过流出曲线的拐点所作的切线在基线的截距，如图9-3中IJ所示。Wb与σ的关系：Wb ＝4σ。 （4）区域宽度 3．理论塔板数 在二十世纪50年代，层析技术发展的初期，Martin等把层析分离过程比作分馏过程，并把分馏中的半经验理论－塔板理论用于层析分析法。 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N=5.54(tR/W1/2)2；N=16(tR/Wb)2 N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 理论塔板高度：H=L/N L----柱长 3．理论塔板数 理论塔板高度越低，在单位长度层析柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。 决定理论塔板高度的因素有： 固定相的材质、 层析柱的均匀程度、 流动相的理化性质 流动相的流速等。 由于同一层析柱对不同物质的柱效能不同，故用理论塔板数（n）和理论塔板高度（H）表示柱效能时应注明被测物质和层析条件。 4．分离度 Rs=（两峰之间的距离）/（平均峰宽） Rs表示色谱峰