实验八：DNA的显示——Feulgen反应.ppt

实验八：DNA的显示——Feulgen反应 【课前预习】 1．Feulgen反应的实验原理和关键步骤是什么？ 2．在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？ 【目的要求】 1．熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法 2．对细胞的免疫组化研究方法有初步的认识 【基本原理】 Feulgen反应（Feulgen reaction）是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。 自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下图所示。 2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3 DNA经温稀酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核酸之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂中的无色品红反应，形成紫红色的化合物， 因此Feulgen反应中，显示紫红色的细胞部位，即标志有DNA的存在。Feulgen反应现仍广泛用于DNA的定性定位和定量的显微测定技术上。 ? 【实验用品】 1．器材 显微镜、立式染色缸、水浴锅 2．材料 香柏油，擦镜纸，盖玻片，载玻片 3．试剂 1）schiff氏试剂 将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠（Na2S2O3）无水亚硫酸钠（NaHSO3），在室温冷暗处至少放置24h（有时需2~3天），使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中（可保存数月或更长时间）。在使用前加入0.5g活性碳, 摇1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。 2）亚硫酸水（洗涤剂）：用200ml普通自来水（不要用蒸馏水, 以免引起误差）、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。 3）1mol/L HCl（水解用）：取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成（应将盐酸缓缓加入水中）。 【方法步骤】 【实验结果】 细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA也会出现阳性反应。 大蒜根尖Feulgen染色 【实验报告】 1．绘图表示Feulgen反应的染色结果。 2．总结Feulgen反应染色结果的影响因素。 * * 小鼠肝切片Feulgen染色 *