高效液相色谱法-课件.pptVIP

常州市高技能人才培训与鉴定 常州工程职业技术学院制药与生物工程技术系 2011-7-14 常州市高技能人才培训与鉴定 高效液相色谱法 2011年7月14日 主要内容 基本原理 仪器 日常维护与简单故障排除 液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成，这种新的色谱法称为高效液相色谱法。 它可用来做液固吸附、液液分配、离子交换、空间排阻色谱分析。 高效液相色谱法 高压：液体作为流动相流经色谱柱时，受到 的阻力较大，施加高压能使液体迅速通过，一般高达150-350 ×105Pa。 高速：载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱法高得多，一般可达1-10mL/min。 高效：高效液相色谱法的柱效能可达3万塔板/米，而气相色谱法的柱效能仅为2000塔板/米。 高灵敏度：采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度，荧光检测器可达10-11 g 。 高效液相色谱法特点 高效液相色谱与气相色谱的比较 样品的热不稳定性 样品分子量 HPLC 室温或低于室温均可作分析测试 气相色谱 样品必须在高温进样口及色谱柱均不会受到任何破坏 HPLC 气相色谱 理论上讲，没有上限 实际上有溶解性的限制 通常情况下 小于 500 amu 高效液相色谱与气相色谱的比较 样品制备 进样量 HPLC 固定相和流动相均参与 气相色谱 溶剂必须具有挥发性，且其通常比被分析物沸点低 HPLC 气相色谱 进样量取决于色谱柱内径 通常情况下为1-5 ?L 高效液相色谱与气相色谱的比较 分离机理 检测器 HPLC 固定相和流动相均参与 气相色谱 流动相仅作为样品载体 HPLC 气相色谱 最常见的是紫外-可见光度计 很广范围的非破坏性检测器 三维检测器 灵敏度可达 pg 对有机化合物最常见的是 FID 液相色谱分离原理 液相色谱是如何完成混合物的分离？ 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离。 石油醚 碳酸钙颗粒 色素 玻璃柱 高效液相色谱仪 液相色谱仪最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。 液相色谱仪的工作过程：输液泵2将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器3将样品导入,流动相将样品带入色谱柱4,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器5，检测到的信号送至数据系统6记录、处理或保存。 高效液相色谱法的分类 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。但在实际应用中由于方法与应用对象的独特，往往采用如下一些比较固定的名称。 高压输液泵 基本要求 流量准确可调。可控制流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度小于±0.5%。 耐高压。要求泵的输出压力在30-60MPa。 流动相液流稳定。输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。 泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。 泵的结构材料应耐化学腐蚀。 常见高压输液泵 输液泵一般分为恒流泵与恒压泵，恒流泵应用更广泛。 气动放大泵（恒压） 双柱塞往复泵（恒流） 脱气 脱气原因 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。 方法 超声波振荡脱气 惰性气体鼓泡吹扫脱气 真空脱气装置 梯度洗脱1 高压梯度： 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。 高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。 梯度洗脱2 低压梯度： 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。 因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往